食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC檢測方法的建立

楊大偉，劉云國 ，譚樂義，周裔斌，祝素珍，王建廣，賈俊濤，姜英輝

(1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002;2.安徽農業大學，安徽合肥230000)

食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC檢測方法的建立

楊大偉1，2，劉云國1，*，譚樂義1，周裔斌2，祝素珍1，王建廣1，賈俊濤1，姜英輝1

(1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002;2.安徽農業大學，安徽合肥230000)

目的:建立食品中A型肉毒梭菌的快速檢測方法。方法:應用PCR結合變性高效液相色譜(DHPLC)技術，以A型肉毒梭菌的A型肉毒神經毒素基因作為靶基因設計特異性引物，PCR擴增的產物經DHPLC技術進行快速檢測。以非A型肉毒梭菌，產氣莢膜梭菌等23株參考菌株做特異性實驗;A型肉毒梭菌DNA稀釋成不同梯度，做靈敏度實驗。結果:與傳統的檢測方法相比，該方法具有很好的特異性，方法靈敏度較高，最低檢出限可達到為111ng/tube。結論:該方法可以快速、準確檢測A型肉毒梭菌，是食品中致病菌快速檢測的新技術。

變性高效液相色譜，A型肉毒梭菌，PCR，檢測

肉毒梭菌屬革蘭氏陽性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，水和土壤中的肉毒梭菌芽孢是造成其食物污染的主要來源［1］。肉毒梭菌代謝產生的肉毒神經毒素能夠抑制神經末梢乙酰膽堿的分泌，導致運動神經和延腦麻痹，根據其抗原性分為A～G型7個型，其中與人類中毒有關的是A、B、E、F型，我國報告由肉毒毒素致病的大多為A型毒素［2－4］。目前實驗室中常用的檢測肉毒神經毒素的方法是基于抗原－抗體反應的針對毒素蛋白的檢測、小鼠致死及中和實驗、膠體金免疫層析法、常規的PCR檢測等，操作比較復雜，工作量大［5］。目前分子生物學方法以及其他一些新技術則快速靈敏、特異性強，符合當前國內外對食品安全檢測的要求。變性高效液相色譜(denaturing high—performance liquid chromatography，DHPLC)作為近幾年才發展起來的新技術，在一些領域已建立了快速、自動化核酸分析新方法。利用樣品分子通過離子對固定相親和力的差異，在用流動相洗脫時，不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移動速率不同而達到分離的目的［6］。本實驗采用PCR結合DHPLC方法，為A型肉毒梭菌檢測提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用菌種 詳見表1;細菌基因組DNA小量純化試劑盒、PCRmaster mix TIANGEN;乙腈 色譜純，購自Honeywell公司。

表1 實驗所用菌株

普通PCR儀 Eppendorf AG22331，德國;變性高效液相色譜儀 NAV－99.4500，Transgenomic公司，美國;電泳儀 北京六一儀器廠;凝膠成像系統Vilber Lourmat公司;高速離心機 Centrifuge TGL－16B，Eppendorf公司，德國。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成 以A型肉毒神經毒素基因作為靶基因，在NCBI網站上進行檢索，選擇適合的序列，運用PrimerPremier5.0軟件設計引物設計特異性擴增引物，用于PCR－DHPLC檢測的引物序列如下:

上游引物:5′－GTTAACATCAATAGTAAGGGGAAT－3′;

下游引物:5′－CCATAACCATTTCGCGTAAG－3′。

引物序列由上海英駿生物工程有限公司合成，預期擴增片段為222bp。

1.2.2 參考菌株模板DNA的建立 按傳統的培養方法分別增菌培養表1中除肉毒梭菌外的20株參考菌株。取菌株的細菌培養液1mL，采用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取細菌DNA，保存于－20℃備用以待檢測，用于特異性實驗。

1.2.3 特異性實驗 以A型肉毒梭菌DNA作為陽性對照，以1.1中參考菌的20種細菌DNA作為陰性對照，按照1.2.4 PCR擴增條件和1.2.5 DHPLC分析條件進行病原菌的PCR、DHPLC特異性實驗。

1.2.4 PCR擴增條件 PCR反應采用20L體系，經過優化得到的最佳反應體系:2×PCRMaster 10μL，引物10μmol/L 各1μL，模板DNA 2μL，加 ddH2O 補足20μL。

最佳反應條件:反應程序如下:

預變性: 94℃ 5min

變性: 94℃ 30s退火: 58℃ 60s延伸: }72℃ 60s 40個循環延長: 72℃ 5min保存: 4℃

1.2.5 DHPLC分析條件 色譜柱:PS.DVB＆C18DNASep色譜柱(4.6min×50mm，粒度3m);柱溫:50℃;流動相:緩沖溶液A濃度為49.9%，緩沖溶液B濃度為 50.1%;流速:0.9mL/min;上樣量:PCR產物5μL。

1.2.6 靈敏度實驗 挑取在37℃培養24h的A型肉毒梭菌菌落，懸浮于3mL0.85%生理鹽水中，10倍梯度稀釋菌液進行平板計數，重復2次，取平均值確定其菌懸液濃度為7.6×106cfu/mL。采用試劑盒提取法制備模板DNA，提取得到的DNA模板10倍梯度稀釋進行PCR－DHPLC檢測，并將上述所得菌懸液10倍梯度稀釋，濃度分別為:1:1.11×108ng/tube;2:1.11×107ng/tube;3:1.11×106ng/tube;4:1.11×105ng/tube;5:1.11×104ng/tube;6:1.11×103ng/tube;7:1.11×102ng/tube;8:1.11×101ng/tube，從而確定反應體系的靈敏度。

2 結果與討論

2.1 特異性實驗

取1.2.2所建立的參考菌株DNA模板進行PCR－DHPLC檢測的特異性實驗。圖1為部分菌種的檢測結果圖譜。經PCR－DHPLC檢測，在供試的23株參考菌株中，只有A型肉毒梭菌出現陽性吸收峰，其余所有菌株均呈陰性。實驗結果表明，本研究自主設計的A型肉毒梭菌檢測引物具有很好的檢測特異性。

圖1 A型肉毒梭菌特異性實驗的PCR－DHPLC吸收峰圖譜

2.2 靈敏度實驗結果

將A型肉毒梭菌001的DNA提取液做10n倍比稀釋進行PCR－DHPLC檢測，并將所得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，并進行比對，如圖2所示，實驗結果表明，DHPLC的最低檢出濃度為111ng/tube，故本研究所建立的方法有很好的檢測靈敏度。

圖2 A型肉毒梭菌靈敏度實驗的PCR－DHPLC吸收峰圖譜

3 討論

常規的A型肉毒梭菌檢測包括增菌和生理生化鑒定，既耗時又復雜，不宜做大批量樣本的檢測，隨著生產規模的擴大，需要大通量的檢測技術，傳統的檢測方法暴露出種種弊端。而在生產上，由于檢測的時間長可能會導致影響產量和銷量。常規PCR凝膠電泳檢測技術雖然檢測成本低，但結果僅靠凝膠上的條帶大小判斷，如果產物條帶較弱，擴增片段大小相差不多時，很難通過肉眼得到準確結果。實時熒光PCR技術具有特異性強，靈敏度高等優勢，卻存在檢測成本高、熒光探針保存時間短等不足［7－8］。

PCR結合DHPLC技術是新近發展起來的高靈敏度、高通量檢測新技術，DNA樣品自動注入，并在緩沖液的攜帶下流經DNA分離柱。根據待檢菌的特有基因序列，設計 PCR引物進行擴增，結合DHPLC技術可分離核酸片段的特點，達到快速、高通量檢測菌的目的［9－10］。本文利用DHPLC能夠吸收檢測DNA片段并具有高度敏感性的特點，針對產A型肉毒神經毒素的特異基因序列進行PCR擴增，采用非變性DHPLC技術，然后利用DHPLC檢測陽性吸收峰，一次可同時自動化分析數百個樣本，達到快速檢測的目的，具有廣泛的實際應用價值。

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［4］王穎群，嚴共華，雷祚榮.PCR檢測產A、B、E、F和G型肉毒神經毒素梭菌的神經毒素基因［J］.中華微生物學和免疫學雜志，1997，17(3):182－184.

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［6］曹際娟，閆平平，于珂，等.變性高效液相色譜檢測霍亂弧菌［J］.遼寧師范大學學報，2008，31(3):348－352.

［7］曹際娟，趙昕，孫哲平，等.PCR結合變性高效液相色譜快速檢測水產品中河流弧菌［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，18(11):2187－2189.

［8］曹際娟，徐君怡，孫哲平，等.變性高效液相色譜高通量檢測動物源性飼料中沙門氏菌和志賀氏菌［J］.飼料工業，2008，29(14):50－53.

［9］徐君怡，曹際娟，鄭秋月，等.變性高效液相色譜檢測沙門氏菌、空腸彎曲菌和腸出血性大腸桿菌［J］.生物技術通報，2009(3):127－131.

［10］徐君恰，曹際娟，鄭秋月，等.變性高效液相色譜檢測食品中致瀉性大腸桿菌［J］.微生物學報，2008，48(11):1526－1531.

Denaturing high performance liquid chromatography
(DHPLC)used in the detection of Clostridium botulinum－A

YANG Da－wei1，2，LIU Yun－guo1，*，TAN Le－yi1，ZHOU Yi－bin2，ZHU Su－zhen1，WANG Jian－guang1，JIA Jun－tao1，JIANG Ying－hui1
(1.Shandong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China;2.Anhui Agriculture University，Hefei 230000，China)

Objective:Quick checking method of Clostridium botulinum was established by polymerase chain reaction(PCR)and denaturing high－performance liquid chromatography(DHPLC).Methods:With gene of Clostridium botulinum’type A botulinum neurotoxin as target gene，the primer was designed and PCR system was optimized.And the twenty－three test strains such as Clostridium perfringens were tested by specific detection.Then different grades of standard strain were obtained by diluting and sensitivity was detected.Results:The PCR－DHPLC methods could test Clostridium botulinum exclusively and sensitively which with the lowest amount of detecting was111ng/tube.Conclusion:The PCR－DHPLC method was rapid and accurate in detection of Clostridium botulinum in food.

DHPLC;Clostridium botulinum－A;PCR;detection

TS207.3

A

1002－0306(2011)06－0398－03

2010－04－21 *通訊聯系人

楊大偉(1984－)，男，碩士在讀，研究方向:農產品貯藏與加工。

國家質檢總局課題(2008IK140，2009IK170)。