高效液相色譜
——串聯(lián)譜法測定櫻桃番茄中四種季銨類農(nóng)藥

張 曦，金 芬，*，錢永忠，*，于志勇，王 靜

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全重點實驗室，北京100081;2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，國家水質(zhì)學重點實驗室，北京100085)

高效液相色譜
——串聯(lián)譜法測定櫻桃番茄中四種季銨類農(nóng)藥

張 曦1，金 芬1，*，錢永忠1，*，于志勇2，王 靜1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全重點實驗室，北京100081;2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，國家水質(zhì)學重點實驗室，北京100085)

建立了4種季銨類農(nóng)藥(矮壯素、燕麥枯、敵草快和縮節(jié)胺)的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(LC－MS/MS)檢測方法。樣品用75%乙腈－水溶液提取，高速離心后取上清液過尼龍濾膜，用親水柱分離，以含0.1%甲酸的水∶乙腈=25∶75(V∶V)作為流動相，在正離子多反應監(jiān)測(MRM)模式下進行測定。4種季銨類農(nóng)藥的線性范圍為0.5～100ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)在0.9982～0.9996范圍內(nèi)，方法檢出限為0.005mg/kg，可以滿足國際限量的要求。在0.04、0.08、0.16mg/kg添加濃度下，4種季銨類農(nóng)藥的回收率為91.4%～106.3%，相對標準偏差(RSD)小于15%。本方法可用于櫻桃番茄樣品中4種季銨類農(nóng)藥的測定。

季銨化合物，農(nóng)藥，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，櫻桃番茄

季銨類化合物作為除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)業(yè)上有著廣泛的應用，常見的季銨類農(nóng)藥包括燕麥枯(Difenzoquat，DF)、敵草快(Diquat，DQ)、矮壯素(Chlormequat，CQ)和縮節(jié)胺(Mepiquat，MQ)等(結(jié)構(gòu)見圖1)。敵草快對生物體的氧化還原活性影響很大，如肺、心、肝、腎等均有不同程度的傷害，世界衛(wèi)生組織將敵草快和燕麥枯歸為中等毒性［1］。近年來有研究表明矮壯素可能對動物的繁殖能力有影響，因此被列為疑似內(nèi)分泌干擾物［2－3］。為此，許多國家對該類農(nóng)藥都有嚴格的檢驗要求和規(guī)定，如歐盟規(guī)定番茄中敵草快和矮壯素為0.05mg/kg［4］，而日本規(guī)定矮壯素和燕麥枯為0.05mg/kg，縮節(jié)胺則為一律標準0.01mg/kg［5］。由于季銨類農(nóng)藥在低pH條件下完全電離，以陽離子形式存在，普通的C18柱對其無法保留，所以對季銨類農(nóng)藥殘留分析的報道較少。已報道的研究有馬鈴薯中的敵草快［6］，水中的敵草快和百草枯［7－9］，番茄及番茄醬中的矮壯素和縮節(jié)胺［10］，糧谷中的矮壯素［11］以及土壤中的矮壯素［12－13］的測定等。目前，主要采用基于不同色譜分離機理(如C18柱、苯基柱及離子交換柱)的液相色譜－質(zhì)譜法測定季銨類農(nóng)藥。雖然目前離子對色譜法是眾多國家推薦的標準方法，但由于其在流動相中添加離子對試劑會對質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染，抑制負離子模式下的信號［14－15］，所以該方法不適用于檢測矮壯素、縮節(jié)胺等物質(zhì)。目前，利用親水色譜柱分析食品中季銨類農(nóng)藥的種類還很少，還沒有能夠同時測定敵草快、燕麥枯、矮壯素及縮節(jié)胺4種季銨類農(nóng)藥的液相色譜－質(zhì)譜法。為此，本研究建立了采用親水柱的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定櫻桃番茄中4種季銨類農(nóng)藥的分析方法。

表1 四種季銨類農(nóng)藥的質(zhì)譜條件參數(shù)

圖1 四種季銨類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

矮 壯 素 (ChlormequatChloride，CQ，99% ±0.5%)、敵草快(diquat dibromide hydrate，DQ，98%)、燕麥枯(difenzoquat methyl sulfate，DF，99%)、縮節(jié)胺(Mepiquat Chloride，MQ，99% ±0.5%) 4 種標準品購自德國Labor Dr.Ehrenstorfer－Schafers公司;甲醇、乙腈 色譜純，德國Merck;甲酸 96%，美國DIMA公司;超純水;其余試劑 均為分析純。

高效液相色譜儀 Aglient 1200，美國安捷倫公司;質(zhì)譜 API2000，美國 AB公司;高速分散機

T18，德國IKA;離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;超純水機 Millipore，美國Millipore公司;尼龍濾膜(0.2μm)。

1.2 樣品預處理

選取一定數(shù)量有代表性的樣品，切碎，于榨汁機中搗碎，均勻分散，稱取搗碎試樣5g(準確至0.01g)于50mL聚丙烯離心管中，加入適量的超純水，使得試樣中的水與超純水的總量為10mL，加入30mL乙腈。在高速勻漿機上勻漿2min，將高速勻漿后的樣品于9000r/min下離心5min。吸取1～2mL上述離心液上清液，過0.2μm尼龍濾膜。將濾液收集于1.8mL樣品瓶內(nèi)，用于測定。

1.3 色譜條件

色譜柱:Atlantis HILIC Silica，150mm ×2.1mm(i.d.)，粒徑 3μm;柱溫:40℃;進樣體積:10μL;流動相:含 0.1% 甲酸的水∶乙腈 =25∶75(V∶V)，流速:0.2mL/min。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源(Ion Source):電噴霧離子源(Turbo IonSpray，TIS)，正離子掃描方式;離子源溫度(Temperature，TEM):500℃;氣簾氣壓力(Curtaingas，CUR):30V;離子噴霧電壓(IonSpray Voltage):5500V;霧化氣壓力(Gas1):50psi;加熱輔助氣壓力(Gas2):55psi;碰撞氣壓力(Collisiongas):4V;駐留時間:200ms。矮壯素和縮節(jié)胺質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的確定

矮壯素(CQ)、縮節(jié)胺(MQ)和燕麥枯(DF)進入一級質(zhì)譜后，很容易產(chǎn)生穩(wěn)定的［M］+，m/z分別為112、114、249。［M］+離子作為母離子進入二級質(zhì)譜后發(fā)生斷裂或重排等反應產(chǎn)生不同碎片離子，CQ產(chǎn)生有顯著豐度的m/z 58.1及63.1離子碎片，MQ產(chǎn)生m/z 58.1和98.2的離子碎片，DF產(chǎn)生m/z 118.0及193.1離子碎片。CQ、MQ和DF的定量離子分別選擇豐度較高的m/z 63.1，58.1和118.0碎片離子，這與現(xiàn)有的文獻報道相一致［16－18］。而DQ進入質(zhì)譜后產(chǎn)生較穩(wěn)定的［M－H］+，［M－H］+離子作為母離子產(chǎn)生碎片離子 m/z 157和78。其中 m/z 157為［M－C2H3］+豐度最高，作為定量離子。

碰撞能量(Collision Energy，CE)是影響碎片離子分布的最重要因素之一，如果CE能量過高，會產(chǎn)生很多小的碎片，造成碎片信息過多過雜，有時對于某些化合物，很高的CE會產(chǎn)生很差的質(zhì)譜圖;而CE能量過低，會造成結(jié)構(gòu)信息不足等。在多離子監(jiān)測(MRM)模式下，可以針對每一對離子進行優(yōu)化。如圖2所示，CQ、MQ和DF在較低的CE值(29～42V)下，每個子離子即可達到最高響應。但對于DQ來說，在 CE 為57V 的條件下，m/z 78［M－C2H3］2+的響應比m/z 157［M－CH4］+高3倍，所以在 DQ定量離子選擇157>78。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

與甲醇相比，乙腈作為流動相能獲得較低的柱壓和較高的響應值，故本實驗選擇乙腈作為流動相的有機相。為了獲得較高的靈敏度和分離效果，本實驗比較了不同流動相配比對4種季銨類農(nóng)藥的分離與靈敏度的影響。如圖3所示，乙腈的比例越高，4種季銨類農(nóng)藥在柱上的保留越強，但峰寬也越大，這就給樣品的定量帶來困難。此外，乙腈比例為75%時靈敏度最高。因此，綜合考慮靈敏度與分析速度，本實驗選擇了乙腈和水相比例為75∶25，作為定量分析的色譜條件。

圖2 不同CE值條件下四種季銨類農(nóng)藥碎片的離子強度注:a－MQ;b－CQ;c－DQ;d－DF。

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1 提取液的優(yōu)化 季銨類化合物的強極性結(jié)構(gòu)決定了其易溶于水的性質(zhì)，因此選擇75%乙腈－水溶液，67%乙腈－水溶液和100%水溶液，分別對加標果蔬樣品中4種季銨類農(nóng)藥進行了提取。在該三種提取液中，4種季銨類農(nóng)藥的回收率均能滿足要求，其中100%水溶液為75%～79%，75%乙腈－水溶液為83%～84%，67%乙腈－水溶液為71%～77%(圖4)。考慮到75%乙腈－水溶液的提取液與液相條件中的流動相配比相同，而其他兩種提取液如果在直接進樣后會由于溶劑效應的影響而造成峰拖尾或變寬，所以必須在進行前重新用流動相轉(zhuǎn)溶，這就增大了結(jié)果的誤差且降低了方法的靈敏度，因此，本實驗選擇75%乙腈－水溶液作為提取液。

2.3.2 提取液用量的確定 不同提取液用量對季銨類農(nóng)藥的回收率也有較大影響，本研究比較了20、40、50mL三個不同體積提取液用量對回收率的影響(表2)。由于櫻桃番茄本身含水量較高，當提取液體積為20mL時，達不到有機相和水相比例為3/1;而當提取液體積為50mL時，櫻桃番茄樣品和提取液幾乎充滿整個離心管，在離心過程中溶液容易從離心管中漏出，污染離心機且影響回收率的結(jié)果。綜合考慮操作的可行性與回收率效果的影響，本方法確定40mL為提取液的體積。

圖3 不同流動相配比條件下四種季銨類農(nóng)藥的靈敏度和分離效果

圖4 不同組成提取液的提取效果

2.4 線性范圍、檢出限、回收率和精密度

用基質(zhì)加標樣品 0.5、1、5、10、20、50、100ng/mL作為工作溶液繪制標準曲線。在上述色譜－質(zhì)譜條件下，得到4種季銨類農(nóng)藥的濃度與峰面積的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)見表3。

在櫻桃番茄樣品中添加濃度分別為0.04、0.08、0.16mg/kg的四種季銨類農(nóng)藥的回收率為91.7%～106.3%，相對偏差在1.5%～12.5%范圍內(nèi)，具體數(shù)據(jù)見表4。以10倍信噪比計算求得4種季銨類農(nóng)藥的儀器檢出限分別為0.05～0.2μg/kg;而方法檢出限為0.005mg/kg，能夠滿足目前國際限量的要求。

2.5 實際樣品的測定

利用上述所建立的分析方法，對北京市水果批發(fā)市場及超市中50個批次的櫻桃番茄樣品進行了分析，結(jié)果表明，其中34個批次的櫻桃番茄中含有矮壯素，濃度范圍在0.01～9.4mg/kg，6個批次的樣品中含有縮節(jié)胺，濃度范圍在0.01～0.38mg/kg，而只有1個批次的樣品中檢出DQ和DF，分別為0.01和0.04mg/kg。

表2 不同提取液體積的提取效果

表3 四種季銨類農(nóng)藥的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表4 櫻桃番茄中4種季銨類農(nóng)藥的加標回收率(%)及相對標準偏差(RSD)

3 結(jié)論

本研究采用親水色譜柱，避免了離子對試劑的使用，克服了由于離子對試劑污染質(zhì)譜負離子模式的缺點，建立了同時測定櫻桃番茄中敵草快、燕麥枯、矮壯素和縮節(jié)銨四種季銨類農(nóng)藥的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法靈敏度高，能夠滿足國際限量的要求。

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Simultaneous determination of quaternary ammonium compounds in tomato by liquid chromatography－tandem mass spectrometry

ZHANG Xi1，JIN Fen1，*，QIAN Yong－zhong1，*，YU Zhi－yong2，WANG Jing1
(1.Key Lab of Agro－product Quality and Safety，Institute of Quality Standards ＆ Testing Technology for Agro－products，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China;2.State Key Lab of Environmental Aquatic Chemistry，
Research Center for Eco－Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085，China)

A method for the simultaneously determination of four representative quaternary ammonium compounds［chlormequat(CQ)chloride，mepiquat(MQ)chloride，deiquat(DQ)dibromide hydrate and difenzoquat(DF)methyl sulfate］，using liquid chromatography－tandem mass spectrometry(LC－MS/MS)system was developed.The chromatographic separation was performed using a hydrophilic interaction liquid chromatography(HILIC)column to avoid LC－MS system contamination with the use of ion－pair reagents.Aqueous solution containing 0.1%formic acid(A)and acetonitrile(B)(75 ∶25，V/V)were used as the mobile phasegavegood chromatographic retention and sensitivity for these four quaternary ammonium compounds(QACs).The recovery was 91.4%～106.3%for the four QACs at three concentration levels.The limit of quantitation(LOQ)for the four QACs in tomato samples were 0.005mg/kg based on the lowest spiked concentration with suitable precision and accuracy.Finally，the method was successfully used to detect residual QACs in cherry－tomatoes.

quaternary ammonium compounds;pesticides;LC－MS/MS;cherry－tomatoes

TS207.5+3

A

1002－0306(2011)06－0394－04

2010－04－14 *通訊聯(lián)系人

張曦(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:食品安全與檢測技術(shù)。

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(0032007228);2008年農(nóng)業(yè)行業(yè)標準制修訂項目資助。