山藥中降糖活性成分的篩選與比較

何鳳玲，葉小利，李學(xué)剛，*，李曉芳，浦 東，李 平，王小華，馮 平

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400716;2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715;3.北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶400700)

山藥中降糖活性成分的篩選與比較

何鳳玲1，葉小利2，李學(xué)剛1，*，李曉芳1，浦 東1，李 平3，王小華3，馮 平3

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400716;2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715;3.北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶400700)

目的:研究山藥中多糖、皂苷、黃酮粗提物對(duì)HepG2細(xì)胞的葡萄糖的消耗作用，對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的降糖作用，以此來(lái)綜合比較三種成分的降糖效果。方法:山藥乙醇提取物經(jīng)(D101)大孔樹脂柱吸附乙醇梯度洗脫、分離純化得到50%含量的總黃酮和60%含量的總皂苷，山藥水提物純化得到多糖，然后分別以HepG2細(xì)胞、糖尿病小鼠為模型研究了三種成分的降血糖效果。結(jié)論:皂苷可增加單位細(xì)胞的葡萄糖消耗量，呈現(xiàn)劑量依賴性。山藥原粉、皂苷和黃酮能顯著降低糖尿病小鼠的飲水量和血糖水平，其中原粉最明顯。推測(cè)在山藥的降血糖作用中三種成分存在協(xié)同效應(yīng)。

山藥多糖，山藥皂苷，山藥黃酮，HepG2細(xì)胞，糖尿病

山藥(dioscoreae rhizoma)為薯蕷科(Dioscorea spp.)植物薯蕷的干燥根莖，性平、味甘，有健脾除濕、補(bǔ)氣益腎等功效。山藥頻繁地出現(xiàn)在治療“消渴病”的經(jīng)典名方中，可見山藥有治療糖尿病的功效，張忠全等人研究發(fā)現(xiàn)山藥多糖能提高血液中的C肽，具有改善受損的胰島B細(xì)胞功能［1］。高洪武發(fā)現(xiàn)山藥中的甾體皂苷對(duì)α－葡萄糖苷酶有抑制作用，可以降低四氧嘧啶小鼠的血糖水平［2］。張婧萱等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明淮山藥中的黃酮對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的·OH有很好的清除作用［3］，并沒(méi)有研究表明山藥黃酮有降糖作用。為了促進(jìn)山藥資源的綜合利用，本文以HepG2細(xì)胞和糖尿病小鼠為模型，系統(tǒng)地研究山藥中多糖、黃酮、皂苷等三種成分的降糖活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

懷山藥 重慶中藥研究所鑒定為懷山藥;HepG2細(xì)胞株 第三軍醫(yī)大學(xué)現(xiàn)代高血壓研究所;特級(jí)胎牛血清 Gibco公司;RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)基、葡萄糖酶法測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;四甲基偶氮唑鹽(MTT) Sigma;其他試劑 均為分析純。

二氧化碳培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠;全自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀 美國(guó)伯樂(lè)公司;EOS BRAVO全自動(dòng)生化分析儀 上海安泰分析儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器有限公司;Hitachi U－1800型紫外分光光度計(jì) 日本Hitachi儀器公司。

表1 山藥各成分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及降糖消耗的影響(x±s，n=3)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山藥浸膏的提取與分離 稱取山藥4kg，用95%乙醇按1∶5比例回流提取3次。合并提取液濃縮得浸膏;將山藥浸膏溶于水，通過(guò)大孔樹酯，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇進(jìn)行洗脫。

1.2.2 山藥總黃酮的純化 將20%和40%組分的合并液烘干，水溶后上聚酰胺柱，分別用水、75%乙醇、100%乙醇洗脫，收集100%組分減壓回收酒精。測(cè)定黃酮含量達(dá)70%左右［4］。

1.2.3 山藥總皂苷的純化 將80%的組分烘干，溶于95%乙醇，滴加過(guò)量的石油醚至剛好有沉淀析出為止，4℃靜置過(guò)夜，離心棄上清液將沉淀烘干，測(cè)定皂苷含量達(dá)78%左右［5］。

1.2.4 山藥總多糖的純化［6］采用硫酸蒽酮法，葡萄糖為對(duì)照品。測(cè)定多糖含量為75%［7］。

1.2.5 HepG2的葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)及MTT實(shí)驗(yàn)［8］培養(yǎng)24h后更換分別含有不同濃度(0.0004、0.002、0.01mg/mL)的黃酮、皂苷、多糖、全浸膏的無(wú)血清培養(yǎng)基。每種濃度設(shè)置3復(fù)孔，設(shè)空白對(duì)照組。孵育24h后，取115μL培養(yǎng)基用葡萄糖試劑盒在全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)葡萄糖殘存量。剩下的培養(yǎng)基中加入15μL MTT，37℃ 孵育4h，加200μL DMSO，振蕩10min，用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

1.2.6 糖尿病模型的建立［9］及分組處理 將小鼠分為6組，即空白組、山藥原粉組、山藥黃酮組、山藥多糖組、山藥皂苷組、高血糖組，每組10只。按中國(guó)藥典(2010)規(guī)定人日常服用最大劑量換算成小鼠用量配制山藥原粉，其余各成分換算成山藥原粉中所含的同等劑量灌胃。空白組和高血糖小鼠組灌胃等量的蒸餾水。每日灌胃一次，同時(shí)記錄飲水量、飲食量，連續(xù)15d，空腹血糖采集禁食12h后的小鼠尾靜脈血測(cè)值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用t檢驗(yàn)，數(shù)值用x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥各成分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及降糖消耗的影響

見表1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與其他成分相比山藥皂苷能明顯增加培養(yǎng)基中HepG2細(xì)胞的葡萄糖的消耗量，同時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。扣除細(xì)胞增殖的抑制作用對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖消耗的影響，用MTT校正后，皂苷可顯著增加單位細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

2.2 山藥各成分對(duì)糖尿病小鼠飲食量的影響

見表2。

表2 各成分組小鼠飲食量比較(n=10)

造模成功的糖尿病小鼠應(yīng)該出現(xiàn)“多食”現(xiàn)象，但是從實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，其他組的飲食量并沒(méi)有增加，反而減少，其中相同時(shí)間下高血糖組進(jìn)食量最少。

2.3 山藥各成分對(duì)糖尿病小鼠飲水量的影響

見表3。

表3 各成分組小鼠飲水量比較(n=10)

結(jié)果表明，四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠相對(duì)空白正常小鼠會(huì)出現(xiàn)多飲現(xiàn)象，相比于高糖組，山藥原粉組糖尿病小鼠的飲水量明顯減少，其次山藥皂苷組、山藥黃酮組飲水量均有不同程度地減少。

2.4 山藥各成分對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響

見表4。

結(jié)果表明，山藥原粉組、黃酮組與空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，山藥多糖組、皂苷組、高糖組與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，給藥后，各給藥組血糖水平均有降低。與高血糖組比較，山藥原粉組、黃酮組、皂苷組、黃酮組實(shí)驗(yàn)前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，實(shí)驗(yàn)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

表4 山藥各成分對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響(x±s，n=10)

3 討論

山藥作為一種藥食兩用性植物，含有豐富的化學(xué)組分［10］，其中對(duì)于降糖活性研究較多的山藥多糖的降糖原理被認(rèn)為是和增加胰島素分泌、改善受損的胰島 B細(xì)胞功能有關(guān)［11］。在檢測(cè)HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)中，在相同濃度下皂苷相對(duì)于多糖、黃酮能顯著促進(jìn)HepG2對(duì)葡萄糖的消耗，并具有劑量依賴性。四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)中，山藥原粉灌胃劑量參照中國(guó)藥典(2010)人體日常服用最大劑量30g/kg換算成小鼠劑量4.5g/kg灌胃，分別檢測(cè)山藥浸膏中黃酮、皂苷、多糖的含量，根據(jù)已知山藥浸膏率換算山藥原粉中各成分的含量，再將已經(jīng)純化的各成分配制成4.5g山藥原粉中所含的質(zhì)量灌胃。實(shí)驗(yàn)中糖尿病小鼠普遍會(huì)出現(xiàn)的“三多一少”現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皂苷組和黃酮組與高糖組相比，血糖水平明顯降低，飲水量減少，比已知具有降糖活性的山藥多糖效果更好。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)山藥原粉在降低血糖值和控制飲水量都比其它單個(gè)成分效果好，推測(cè)山藥的降血糖作用可能是山藥黃酮、山藥皂苷、山藥多糖協(xié)同作用的結(jié)果。

［1］張忠泉，陳百泉，等.山藥多糖對(duì)大鼠血糖及胰島釋放影響的研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2003，10(7):52－53.

［2］高忠武.山藥甾體皂甙的分離提取及其在小鼠體內(nèi)降糖活性研究［D］.上海大學(xué)碩士學(xué)位論文.

［3］張婧萱，廖保寧，等.淮山藥中總黃酮的提取及對(duì)羥自由基的清除作用［J］.微量元素與健康研究，2007，24(1):44－54.

［4］馮志毅，趙獻(xiàn)敏，等.卷柏總黃酮純化工藝研究［J］.中成藥，2009，31(4):544－546.

［5］洪艷平，尹忠平，等.山藥總甾體皂苷提取與測(cè)定［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2008，8(8):46－50.

［6］李義，李紅霞，等.山藥水溶性粗多糖提取工藝的研究［J］.飼料工業(yè)，2005，26(16):45－47.

［7］杜家方，張重義.不同品種懷山藥總多糖含量與干物質(zhì)積累分配比較［J］.江蘇中醫(yī)藥，2008，40(8):57－59.

［8］汪寧，朱荃，等.桑寄生對(duì)培養(yǎng)的人HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗作用的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24(3):442－443.

［9］郜宏麗，等.山藥多糖對(duì)糖尿病小鼠降血糖作用［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2006，22(7):804－805.

［10］趙宏，謝曉玲，等.山藥的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.今日藥學(xué)，2009，19(3):49－51.

［11］胡國(guó)強(qiáng)，楊保華，等.山藥多糖對(duì)大鼠血糖及胰島釋放的影響［J］.山東中醫(yī)雜志，2004，4(4):230－231.

Study on filtration and comparison of hypoglycemic bioactive components in dioscoreae rhizome

HE Feng－ling1，YE Xiao－li2，LI Xue－gang1，*，LI Xiao－fang1，PU Dong1，LI Ping3，WANG Xiao－h(huán)ua3，F(xiàn)ENG Ping3
(1.College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400716，China;2.School of Life Science，Southwest University，Chongqing 400715，China;;3.Beibei traditional Chinese Medical Hospital，Chongqing 400700，China)

Objective:To study the effect of extracts of dioscorea rhizome－polysaccharides，saponins and flavones to HepG2 cell with the subject of consumption glucose affection and to hypoglycemic action effect to the diabetic mice model established intra－abdominal injection of alloxan in order to compare the three components’hypoglycemic bioactive.Methods:using the D101 macroporous resin adsorption process for the ethanol extracts of dioscoreae rhizome，elution with different concentration of ethanol.Depurating get 50%flavones content or so，and 60%saponins，and get polysaccharides from extracts of dioscoreae rhizome by water.Then use HepG2 cell and the diabetic mice as model to study three components hypoglycemic affections.Results:It demonstrated that saponins could lead to adding consumption of glucose in unit cell and make model dose－dependent.Dioscoreae rhizome，saponins and flavones could decrease the water drinking volume of diabetic mice and level of glucose.Dioscoreae rhizome was best.It concluded that three components showed synergistic effect among dioscoreae rhizome’s dhypoglycemic bioactive base on the experiment.

dioscoreae rhizome polysaccharides;dioscoreae rhizome saponins;dioscoreae rhizome flavones;HepG2 cell;diabetic

TS201.4

A

1002－0306(2011)06－0373－03

2010－07－15 *通訊聯(lián)系人

何鳳玲(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:化學(xué)與生物藥物分析。

重慶市攻關(guān)項(xiàng)目(CSTC，2010AC5007);重慶市科委攻關(guān)項(xiàng)目(CSTC 2010AC5007)。