蒜頭果淉中蛋白質(zhì)的提取工藝研究

唐婷范，劉雄民，凌 敏

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004)

蒜頭果淉中蛋白質(zhì)的提取工藝研究

唐婷范，劉雄民*，凌 敏

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004)

以提油脂后的蒜頭果渣為原料，測定了蒜頭果渣中蛋白質(zhì)含量。通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化蛋白質(zhì)提取的工藝條件。結(jié)果表明，蒜頭果渣的蛋白質(zhì)含量為31.07%，蛋白質(zhì)提取的優(yōu)化工藝條件為:提取溫度為室溫，提取溶劑為磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，提取時間為3h，料液比(W/V)為1∶25。在此優(yōu)化條件下，蛋白質(zhì)提取率為86.01%。

蒜頭果渣，蛋白質(zhì)，提取，正交設(shè)計

蒜頭果(Malania oleifera Chun et S.K Lee)為鐵青樹科馬蘭木屬，又稱山桐果，是我國特有的單種屬植物，分布在廣西西部和云南東南部的狹窄地帶［1］，已被列為國家二級保護(hù)植物［2］。有關(guān)蒜頭果揮發(fā)油、油脂的提取分離及應(yīng)用研究已有大量文獻(xiàn)報道［3－7］。蒜頭果仁除含60%左右的油脂外，還含有大量的植物蛋白質(zhì)。戴曉暢等［8］在不高于4℃下從蒜頭果仁中提取純化得到一種對人體多種癌細(xì)胞具有強(qiáng)烈抑制作用的蒜頭果蛋白質(zhì);袁燕等［9－14］也進(jìn)行了蒜頭果蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、熒光光譜和毒性研究。這些研究的重點是在較低溫下提取純化蒜頭果蛋白質(zhì)，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征與生物活性實驗。有關(guān)從蒜頭果仁提取油脂后而蒜頭果渣提取蛋白質(zhì)的工藝研究沒有受到重視，影響蒜頭果綜合利用價值，殘渣廢棄對環(huán)境有影響。本工作利用溶劑提取油脂后的蒜頭果渣為原料，進(jìn)行蒜頭果渣蛋白質(zhì)含量的測定和蛋白質(zhì)提取工藝的研究，探索具有應(yīng)用前景的提取方法和技術(shù)路線，為綜合利用蒜頭果渣資源提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒜頭果 產(chǎn)于廣西巴馬縣;硫酸銅、酒石酸鉀鈉、硫酸鉀、氫氧化鈉等 以上試劑均為國產(chǎn)分析純;牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA) Promega公司。

721 型分光度儀 上海第三分析儀器;LD5－10型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;pHS－3C型精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;微型植物粉粹機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;半微量凱氏定氮裝置 泉州萬達(dá)實驗儀器設(shè)備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒜頭果渣蛋白質(zhì)含量的測定 采用半微量凱氏定氮法［15］。準(zhǔn)確稱取0.05g樣品，經(jīng)消化，冷卻后稀釋至100mL容量瓶中。將冷凝管下端插入2%硼酸液并加5滴混合指示劑(甲基紅－次甲基藍(lán))的容器的液面下，然后取樣品消化液25mL于反應(yīng)室中，再加入50%氫氧化鈉溶液4mL，迅速蓋塞，通入蒸汽，蒸出50mL左右即可。用0.05mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定至藍(lán)紫色為終點，平行測定三次，同時做空白樣。

式中:N－鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(mol/L);V1－樣品滴定時消耗鹽酸的體積(mL);V0－空白樣滴定時消耗鹽酸的體積(mL);W－果渣的質(zhì)量(g);6.25－含氮量換算為蛋白質(zhì)的換算系數(shù)。

1.2.2 蒜頭果渣蛋白質(zhì)的提取 將脫除油脂后的蒜頭果渣粉碎，過60目篩。準(zhǔn)確稱取一定量的原料，加入一定料液比的提取溶劑，于一定溫度下提取一定時間，提取液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，取上清液用721型分光光度計測定吸光度，收集上清液(提取液)，濃縮，干燥后得粗蛋白。

1.2.3 提取液中蛋白質(zhì)含量的測定 采用雙縮脲法［16］。首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取一系列試管，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL的5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液，用水補(bǔ)足至1mL，然后加入4mL雙縮脲試劑在室溫下(15～25℃)放置30min，于540nm波長下用721型分光光度計測定光密度。最后以光密度為縱坐標(biāo)，牛血清蛋白的含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為:

A=0.0494C－0.0013，相關(guān)系數(shù)r=0.9996，線性范圍為0.50～5.00mg/mL。

式中:A為樣品在540nm處的吸光度;C為樣品濃度(mg/mL)。

通過測量吸光度計算出提取液中蛋白質(zhì)含量:

蛋白質(zhì)提取率(%)=提取液中蛋白質(zhì)含量×提取液體積/(蒜頭果渣蛋白質(zhì)含量×蒜頭果渣取樣量)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 蒜頭果渣中蛋白質(zhì)含量

按1.2.1進(jìn)行實驗，測得蒜頭果渣蛋白質(zhì)含量為31.07%。

2.2 提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

為確定適宜的提取溫度，考察溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響。稱取5g的果渣，加入料液比為1∶25的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，于4℃、室溫、40℃、55℃和70℃條件下提取3h，按1.2.2進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可知，室溫以下，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的提取率逐漸增大，室溫下提取率達(dá)到最高，但隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的提取率逐漸降低，說明溫度對蛋白質(zhì)的溶解性和穩(wěn)定性的影響較大，可能是溫度升高引起蛋白質(zhì)變性，影響了蛋白的溶解性。綜合考慮蛋白質(zhì)提取率、提取成本和穩(wěn)定性，以室溫為宜。

2.3 提取溶劑對蛋白質(zhì)提取率的影響

為確定適宜的提取溶劑，考察提取溶劑對蛋白質(zhì)提取率的影響。在室溫下，稱取5g的果渣，分別以10%乙醇、水、氯化鈉溶液(0.15mol/L)、磷酸鹽緩沖液(pH7.5)和Tris－HCl緩沖液(pH7.5)為提取溶劑，料液比為1∶25，提取時間為3h，按1.2.2進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖2。

圖2 不同浸提液對蛋白質(zhì)提取率的影響注:1.10%乙醇;2.水;3.氧化鈉溶液;4.磷酸鹽緩沖液;5.Tris－HCl緩沖液。

由圖2可知，蛋白質(zhì)在五種溶劑中的溶解性為:10%乙醇＜水＜Tris－HCl緩沖液＜氯化鈉溶液＜磷酸鹽緩沖液。說明蛋白質(zhì)在不同溶劑中的溶解度不同，后三種溶劑對蛋白質(zhì)的溶出率較高。原因是稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解性大。故磷酸鹽緩沖液為適宜的提取溶劑。

2.4 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

為確定蛋白提取的適宜時間，考察時間對蛋白質(zhì)提取率的影響。在室溫下，稱取5g的果渣，加入料液比為1∶25的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，分別以1、2、3、4、5h為提取時間，按1.2.2進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，提取時間在1～3h區(qū)間內(nèi)，提取率升高比較明顯，3h之后逐漸趨于平穩(wěn)。當(dāng)提取時間低于2h時，提取率偏低，可能是由于蒜頭果渣本身需要一定的溶脹時間，但長時間的提取會使部分蛋白變性，綜合考慮蛋白質(zhì)提取率和提取成本各方面因素，一般選提取時間3h為宜。

2.5 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

為確定蛋白提取適宜的料液比，考察料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響。在室溫下，稱取5g的果渣，加入料液比(W/V)分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，提取3h，按1.2.2進(jìn)行實驗，結(jié)果見圖4。

圖4 不同料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知，隨料液比的增大，蛋白質(zhì)的溶出率也在增大，在料液比為1∶20后蛋白質(zhì)溶出增加緩慢。料液比較小時，提取率不是很高，這是因為蒜頭果渣蛋白在溶液中具有一定的溶解度，在蛋白質(zhì)溶解達(dá)到飽和時，過量的蛋白質(zhì)不再溶解，提取率不再提高。考慮到后面離心、蛋白質(zhì)分離等工序，由此確定適宜的料液比為1∶25。

2.6 提取工藝條件的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，分別選取提取溫度4～40℃，提取溶劑:氯化鈉溶液(0.15mol/L)、磷酸鹽緩沖液(pH7.5)和Tris－HCl緩沖液(pH7.5)，提取時間2～4h，料液比(W/V)1∶15～1∶25 4個因素3個水平，采用正交實驗L9(34)，按1.2.2進(jìn)行實驗，以蒜頭果渣蛋白質(zhì)提取率為評價指標(biāo)，優(yōu)化提取蛋白質(zhì)的工藝條件，實驗方案如表1所示。

表1 正交實驗的因素水平表

對實驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表2所示。

表2 正交實驗結(jié)果及極差分析

從表2極差分析結(jié)果可知，各因素對蛋白提取率的影響順序為:溫度(B)>料液比(D)>時間(C)>提取溶劑(A)，蒜頭果渣中蛋白最優(yōu)提取方案為A2B2C2D3。即提取溶劑為磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，溫度為室溫，提取時間為3h，料液比為1∶25。在此條件下，按1.2.3公式計算蛋白質(zhì)提取率為86.01%。

3 結(jié)論

本文進(jìn)行了蒜頭果渣蛋白質(zhì)的研究，得出了如下結(jié)論:

采用半微量凱氏定氮法測得蒜頭果渣的蛋白質(zhì)含量為31.07%。通過單因素實驗和正交優(yōu)化組合得出蒜頭果渣中蛋白提取的最佳工藝為:提取溫度為室溫，提取溶劑為磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，提取時間為3h，料液比為1∶25。在此優(yōu)化工藝條件下，用雙縮尿法測定提取液中蛋白質(zhì)的含量，計算蛋白質(zhì)提取率為86.01%。

本法提取蒜頭果渣中蛋白的工藝流程簡單，成本較低，提取率較高，可據(jù)此進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。

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Study on extraction technology of protein from Malania Oleifera Chun residue

TANG Ting－fan，LIU Xiong－min*，LING Min
(College of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University，Nanning 530004，China)

The content of protein was measured，and single factor experiment and orthogonal factor experiment were carried out to optimize the extraction technology，which was used to extract the protein from Malania oleifera Chun residue.The results showed that the content of protein in Malania oleifera Chun residue was 31.07%，the optimum conditions were as follows:the extraction temperature was room－temperature，the extraction solvent was phosphate buffer solution，and pH7.5，the extraction time was 3 hours and the ratio of material to liquid was 1∶25.Under this condition，the extraction rate reached 86.01%.

Malania Oleifera Chun residue;protein;extraction;orthogonal design

TS201.21

B

1002－0306(2011)06－0323－03+

2010－07－06 *通訊聯(lián)系人

唐婷范(1988－)，女，博士研究生，研究方向:天然產(chǎn)物化工。

廣西科學(xué)基金項目(桂科基0832002)。