生物酶法合成植物甾醇酯的研究

于殿宇，王騰宇，陳 昊，朱秀清，江連洲，，胡立志，*

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030;2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

生物酶法合成植物甾醇酯的研究

于殿宇1，王騰宇1，陳 昊2，朱秀清2，江連洲1，2，胡立志2，*

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030;2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030)

采用生物酶法對葵花油與植物甾醇的酯交換反應技術參數和條件進行了探索。采用Novozym 435脂肪酶，催化植物甾醇與油脂的酯交換反應。通過單因素與正交實驗，確定了最佳工藝參數:甾醇濃度5%，酶添加量1%，反應時間3h，反應溫度100℃，攪拌速度600r/min，在最佳條件下酯交換反應的酯化率達到89.7%。

植物甾醇，葵花油，酯交換反應，脂肪酶

甾醇(sterol)又被稱為類固醇(steroids)，是天然有機物質中的一大類，動植物組織都有。動物體內普遍含有膽甾醇，一般稱為膽固醇(cholesterol);植物中的膽甾醇含量很少，主要為植物甾醇。至今已發現100多種植物甾醇，含量較豐富的，主要包括β－谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等［1－2］，其化學結構與膽固醇非常相似，僅側鏈結構不同。自從植物油中發現谷甾醇等植物甾醇以來，近百年來人們對植物甾醇進行了廣泛深入的探討，甾醇也被譽為“生命的鑰匙”［3］。甾醇為白色結晶，具有旋光性，不溶于水，易溶于二硫化碳、氯仿、乙醚、苯等溶劑，難溶于乙醇和丙酮，不溶于水、酸和堿。其分子所含的碳原子數一般為27～31個，分子量大致為386～456，熔點均高于100℃。植物甾醇的生理功能十分重要，如降膽固醇、抗癌作用、類激素功能、抗炎作用、免疫調節、調節生長、抗病毒等［4］，所以廣泛應用于醫藥行業。并且由于其是一種W/O型乳化劑，可以很好地提高乳化穩定性和對皮膚溫和的滲透力，也可以作為化妝品的原料，同時由于其無毒無害，也廣泛應用于食品行業、飼料行業和印刷行業等。隨著我國經濟的不斷發展，居民生活水平的不斷提高，據統計，我國血脂異常總患病率為18.6%;18歲以上血脂異常人數已達到1.6億，并且這一數字還在不斷增加。大量的流行病學資料和實驗室研究證明，人體攝入的植物甾醇越多，罹患心腦血管疾病的概率就越低，所以應加大植物甾醇的攝入量。人體不能合成植物甾醇，必須從外界攝取，但是由于游離的植物甾醇在水和油脂的溶解度非常低從而大大降低了其生理作用。植物油中甾醇主要以游離形式和脂肪酸酯形式存在［5］，但是植物甾醇酯有更優的脂親和性和更佳的降膽固醇效果［6］。2000年FDA批準植物甾醇酯可作為功能性食品配料。2007年我國衛生部正式批準植物甾醇酯為“新資源食品”。含有植物甾醇的保健功能性油脂是植物甾醇和甘三酯的脂肪酸經酯化后添加到油脂中的一項新技術。在我國人民健康和保健意識逐漸提高的趨勢下，開發具有保健功效的食用油新產品，在提升食用油的健康指標，提高居民健康水平和預防疾病等方面，有著非常重大的社會效益和經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

植物甾醇 西安藍天生物工程有限責任公司;葵花油 大連圣基生物制品有限公司;Novozym 435脂肪酶 丹麥Novozymes公司;其他試劑 均為化學純。

恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪高科儀器廠;LD4－2A低速離心機 北京醫用離心機廠;XW－80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠;722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物甾醇酯的合成 精確稱量一定量的植物甾醇、葵花油和Novozym 435脂肪酶，連同轉子一同加入錐形瓶中，置于集熱式磁力攪拌器中，調整溫度、攪拌速度，反應一定時間。反應完成后，在3000～4000r/min條件下離心20min，取出上層油脂制品。1.2.2 標準曲線的制作 將甾醇溶解于乙酸酐中，配制成濃度為100μg/m L的溶液并吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0m L分別置于10m L試管內，在各管內加入乙酸酐使總體積均達到4m L。加入2滴濃硫酸，30min后，在660nm波長下比色。以膽固醇濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出標準曲線。

1.2.3 酯化率的測定 將制取的植物甾醇酯3～4滴，置于25m L試管內，準確記錄其重量。加入4m L無水乙醇，0.5m L 50%氫氧化鉀溶液，在65℃恒溫水浴中皂化1h。皂化時每隔20～30min振搖一次使皂化完全。皂化完畢，取出試管，冷卻。加入3m L 5%氯化鈉溶液，10m L石油醚，蓋緊玻塞，在電動振蕩器上振搖2min，靜置分層(一般約需1h以上)。

取上層石油醚液2m L，置于10m L試管內，在65℃水浴中用氮氣吹干，加入4m L乙酸酐，2滴濃硫酸，混勻，靜置20m in后在660nm波長下比色，測得吸光度，在標準曲線上查出相應的植物甾醇含量。

1.2.4 酯化率的計算 計算公式如下:

式中:X－酯化率，%;m－測得的吸光度值在膽固醇標準線上顯示的膽固醇含量，μg;V－石油醚總體積，m L;V1－取出的石油醚體積，m L;m1－稱取油樣品脂量，g;m2－稱取油脂中植物甾醇量，mg;m3－油脂制品量，g;m4－添加的植物甾醇量，mg;1/1000000－折算成每1g油脂制品植物甾醇酯毫克數。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 溫度對酯化率的影響 在植物甾醇濃度10%，酶用量1%，轉速300 r/m in，反應時間3h的條件下，考察不同溫度對甾醇酯化率的影響見圖1。酶的最佳反應溫度為70～80℃，高溫會使酶變性失活。但是酶具有被油脂中的游離水激活這一特性，由于油脂中的含水量極低，水分過多反而會鈍化酶的活性。因此，本實驗中甘三酯的酯交換反應可以在含水量非常低而無游離水添加的高溫下反應。從圖1可以看出，在60～100℃這一范圍內，酯交換隨著反應溫度的升高而增加，100～110℃酯化率開始下降。這是因為酶的活性隨著溫度的上升而提高，達到最大適應溫度以后，再升高溫度會使酶變性失活，從而使酯化率下降。因此，選擇反應溫度為100℃。

圖1 不同溫度對酯化率的影響

2.1.2 甾醇濃度對酯化率的影響 在酶用量1%，轉速300r/min，反應時間3h，反應溫度100℃的條件下，考察不同甾醇濃度對甾醇酯交換的影響見圖2。從圖2可以看出，植物甾醇的濃度為5%時酯化率最高。隨著植物甾醇濃度的增加，酯化率呈下降趨勢。實驗發現，植物甾醇濃度低于5%時，反應并不完全，超過15%以后，不能完全溶解于葵花油中，酯交換反應緩慢。因此，甾醇濃度5%為最佳原料配比。

圖2 不同植物甾醇濃度對酯化率的影響

2.1.3 酶用量對酯化率的影響 在植物甾醇濃度5%，轉速300 r/m in，反應時間3h，反應溫度100℃條件下，考察不同酶用量對甾醇酯化率的影響見圖3。從圖3可以看出，酶用量為1%時酯化率最大，隨著酶用量的增加，酯化率呈下降趨勢。因此，酶用量1%為最佳條件。

圖3 不同酶用量對酯化率的影響

2.1.4 反應時間對酯化率的影響 在植物甾醇濃度5%，酶用量1%，轉速300r/min，反應溫度100℃條件下，考察不同反應時間對甾醇酯酯化率的影響見圖4。從圖4可以看出，隨著反應時間的延長，酯化率增加并不十分明顯，并且反應時間過長還有增加發生副反應的機率。從經濟角度來看，選擇反應時間3h。

2.1.5 攪拌速度對酯化率的影響 在植物甾醇濃度5%，酶用量1%，反應時間3h，反應溫度100℃條件下，考察不同攪拌速度對甾醇酯酯化率的影響見圖5。由于攪拌一方面可以使葵花油分子、甾醇分子和酶之間的接觸面積增大，使酯交換反應產物均勻;另一方面還可以使傳質均勻，有利于酯交換反應的進行。由圖5可以看出，隨著攪拌速度的提高，酯化率明顯增加。但由于實驗室條件所限，600 r/m in為最大攪拌速度。因此，選擇600 r/min為最佳攪拌速度。

圖4 不同反應時間對酯化率的影響

圖5 不同攪拌速度對酯化率的影響

2.2 正交實驗

根據單因素實驗的結果，得出影響酯化反應的主要因素，即反應時間、甾醇濃度、酶用量、攪拌速度。選用L9(34)正交表進行正交實驗，反應時間為3h，確定最佳反應條件，以得到酯化率較高的油脂制品。因素水平表見表1，正交實驗結果見表2。

表1 正交實驗因素水平表

從表2中可以看出，A2B1C2D3為最佳條件，即:反應溫度100℃、在植物甾醇濃度5%、酶用量1%、攪拌速度600r/min。各因素對甾醇酯化反應的影響主次順序為:甾醇濃度>反應溫度>酶用量>攪拌速度，按照得到的最佳條件進行實驗，酯化率為89.7%。

表2 正交實驗結果

3 結論

本實驗所介紹的方法，反應過程中無對人體有毒有害化學試劑的使用，有效避免了試劑殘留對人體健康影響的問題，使甾醇制品更加安全、放心。植物甾醇酯制品可以很好地添加到食品、油脂中，不僅滿足人們的營養需求，更具有保健功能。

通過單因素與正交實驗綜合分析，最終確定最佳反應條件:植物甾醇濃度5%，酶用量1%，反應時間3h，反應溫度100℃，攪拌速度600r/min，酯化率為89.7%。

［1］FERNANDESP， CABRAL J M S Phytosterols:applicationsand recovery methods［J］.Bioresource Technology，2007，98:2335－2350.

［2］KRITCHEVSKYD，CHEN S C.Phytosterols－health benefits and potential concerns:a review ［J］.Nutr Res，2005，25:413－428.

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［4］曹萬新，孟橘，陳吉江，等.精煉過程中玉米油甾醇含量的變化［J］.中國油脂，2009，34(8):16－18.

［5］寇明鈺，闞健全，趙國華，等.植物甾醇來源、提取、分析技術及其食品開發［J］.糧食與油脂，2004(8):9－13.

［6］陳茂彬，黃琴.植物甾醇乙酸酯和植物甾醇油酸酯抗腫瘤作用初探［J］.中國油脂，2003，28(9):49－51.

Study on synthesis of phytosterol esters using enzymatic method

YU Dian－yu1，WANG Teng－yu2，CHEN Hao2，ZHU Xiu－qing2，JIANG Lian－zhou1，2，HU Li－zhi2，*
(1.Northeast Agricultural University Food College，Harbin 150030，China;2.Northeast Agricultural University，National Research Center of Soybean Engineering ＆ Technology，Harbin 150030，China)

Transesterification was conducted in sunflower oil with phytosterol by Novozym 435 lipase catalyzation.The optimum conditions were obtained by the single factor and orthogonal tests.Phytosterol concentration was 5%，the usage of lipase was 1%，the reaction time was 3h，the reaction temperature was 100℃，and the stirring speed was 600r/min.The esterification rate was 89.7%under the optimum conditions.

phytosterol;sunflower oil;transesterification;lipase

TS201.1

B

1002－0306(2011)06－0318－03

2010－06－01 *通訊聯系人

于殿宇(1964－)，男，教授，碩士，主要從事大豆油脂加工技術研究。

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(11551064);黑龍江省2009科技攻關項目(WB09B201－1)。