均勻設計法在雞血紅素吸時提取中的應用

區子弁，王 琴，何淑儀

(仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225)

均勻設計法在雞血紅素吸時提取中的應用

區子弁，王 琴*，何淑儀

(仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225)

目的:借助均勻設計，確立雞血紅素吸附提取的最優工藝。方法:以新鮮抗凝雞血為原料，經超聲波溶血后，比較了pH、吸附時間、吸附劑添加量、吸附劑種類對雞血中血紅素提取的影響。結果:以血紅素得率為指標，實驗的最優條件為pH為5.2，吸附劑添加量2.4%(w/v)，吸附時間8h，選用CMC作吸附劑時，血紅素得率可達最大值2.848%(w/v);以血紅素純度為指標，實驗的最優條件為pH為4.8，吸附劑添加量3.1%(w/v)，吸附時間5h，選用CMC作吸附劑時，血紅素純度可達最大值3.04%(w/v)。

雞血紅素，均勻設計，吸附提取

血紅素為一種含鐵的卟啉類化合物，作為血紅蛋白的輔基，大量存在于人和哺乳動物血液的紅細胞中，起著運輸氧的重要功能。20世紀80年代初，人們開始應用血紅素治療缺鐵性貧血，收到比傳統鐵制劑諸如硫酸亞鐵、富馬酸鐵、葡萄糖酸亞鐵等更顯著的療效［1］。同時開始對牲畜血中提取血紅素的方法進行多方面的改進［2－3］。血紅素作為預防和治療缺鐵性貧血的有效制劑，探索一種經濟、簡便而高效的提取制備方法，一直被相關專業工作者所重視［4－5］。考慮到一些增稠劑具有獨特的吸附作用，且在吸附血紅素的同時其自身亦能作為食品的賦形劑，本文采用吸附法提取雞血紅素，并借助均勻設計優化提取工藝，以求為雞血的深加工提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞血 購自廣州市遠安路市場;血紅素標準品南京奧多福尼生物科技有限公司，純度≥98%;其他常規試劑 均為分析純。

TU－1810PC紫外－可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;PHS－3C精密pH計 上海精密儀器儀表有限公司;TDL－5－A離心機 上海安亭科學儀器廠;DZF－250真空干燥機 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 血紅素制備 新鮮雞血加8g/L檸檬酸鈉做抗凝劑，攪拌均勻，3600r/min離心15min，傾出上清液，收集紅細胞，再用9g/L的生理鹽水洗滌紅細胞2次，離心取濃縮紅細胞。將干凈的紅細胞加入一定量的去離子水和乙醇，超聲波處理溶血后，過濾，沉淀部分用酸攪拌抽提，抽濾，濾液用NaOH溶液調pH至析出沉淀，加入吸附劑，靜置抽提，3600r/min離心，取沉淀，用等體積去離子水和無水乙醚分別洗滌2次，離心，真空干燥得粗品血紅素。

1.2.2 血紅素含量測定

1.2.2.1 血紅素最大吸收波長的測定 精確稱取血紅素標準品0.0200g，置于50mL燒杯中，用0.1mol·L－1NaOH溶解后轉移至100mL容量瓶中，另用同濃度的NaOH溶液分3次洗滌燒杯，洗滌液合并至容量瓶并稀釋至刻度，即成血紅素標準貯備液。精密量取血紅素標準貯備液2.0mL，置于10mL比色管中，用0.1mol·L－1NaOH定容，搖勻，即成血紅素標準供試液。設定紫外－可見分光光度計的波長范圍為300～540nm，掃描間距0.5nm。以0.1mol·L－1NaOH 溶液為空白，校正基線后向同一比色皿加入血紅素標準供試液，測定血紅素的最大吸收波長［6］。本標準品經測定其最大吸收波長為396nm。

1.2.2.2 標準曲線的繪制 血紅素標準貯備液的制備如1.2.2.1所述。然后精密量取血紅素標準貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別置于 6 個 10mL 比色管中，用0.1mol·L－1NaOH 定容，搖勻，即成血紅素標準系列供試液。以0.1mol·L－1NaOH溶液為空白，在最大吸收波長下測定各自的吸光度。得回歸方程 y=0.01328x－0.00961，R2=0.9991。

1.2.2.3 血紅素樣品濃度的測定 精確稱取血紅素樣品約1g，置于50mL燒杯中，用0.1mol·L－1NaOH溶解后轉移至100mL容量瓶中，另用同濃度的NaOH溶液分3次洗滌燒杯，洗滌液合并至容量瓶并稀釋至刻度，即成血紅素樣品貯備液。精密量取血紅素樣品貯備液2.0mL，置于10mL比色管中，用0.1mol·L－1NaOH定容，搖勻，離心后取上層清液測定吸光度(以0.1mol·L－1NaOH 溶液做空白)。

1.2.2.4 血紅素提取工藝的均勻實驗設計 根據血紅素提取工藝的影響因素與水平，將按照U6(63×3)混合水平均勻設計表安排實驗，如表1所示。

表1 血紅素提取工藝的均勻設計實驗安排［U6(63×3)］

1.2.2.5 檢測指標 考慮到最終產物血紅素的得率和純度均較為重要，故實驗的檢測指標有兩個——血紅素得率和血紅素純度，其計算公式分別如下所示。在稱量吸附劑質量變化前應把沉淀物用等體積的無水乙醚、去離子水分別洗2次，離心后待無水乙醚完全揮發，再置于真空干燥箱內烘干。

血紅素得率(%)=Δ(吸附劑吸附前后質量變化)/樣品提取液初始體積×100%

2 結果與分析

2.1 血紅素提取工藝的均勻設計實驗結果

按照表1的安排，所得實驗結果如表2所示。

表2 均勻設計實驗結果

2.2 均勻設計實驗結果分析

2.2.1 以血紅素得率為指標 采用DPS數據處理系統軟件中的多因子及互作項逐步回歸分析，結果如表3所示。得出回歸模型優化表達式:y=－8.44617351+1.9005105425x1+7.391266004x2－1.2809120271x1x2－0.11691808024x2x4

此回歸方程相關系數R=0.999972，調整后的相關系數 Ra=0.999862，總體顯著性檢驗值 F=4531.9904，顯著水平達到p=0.0095，剩余標準差SSE=0.0142，因此該方程的可信度較高。同時根據方程對血紅素得率進行預測，當x1(pH)為5.2，x2(吸附劑添加量)=2.4%，x3(吸附時間)=8h，x4(吸附劑種類)為CMC時，得到y(血紅素得率)最大預測值為2.91%。

表3 均勻設計逐步回歸分析結果(以血紅素得率為指標)

根據回歸分析所得出的上述4個因素的最優值重新組合并進行優化實驗，結果如表4所示。

表4 優化實驗結果(以血紅素得率為指標)

由表4優化實驗結果可知，實測平均值為2.848%，與模型預測值2.91%相差不大。通過t檢驗分析可知，t=－0.421 ＜t0.05(4)=2.776，p=0.695，因此，可知實測平均值與模型預測值沒有顯著差異，這進一步說明回歸方程可信度較高。

因此，當以血紅素得率為指標，實驗的最優條件為pH為5.2，吸附劑添加量2.4%(w/v)，吸附時間8h，選用CMC作吸附劑時，血紅素得率可達最大值2.848%(w/v)。

2.2.2 以血紅素純度為指標 采用DPS數據處理系統軟件中的多因子及互作項逐步回歸分析，結果如表5所示。

表5 均勻設計逐步回歸分析結果(以血紅素純度為指標)

得出回歸模型優化表達式:y=2.328358804+1.5881594684x2－0.25747698149x1x2+0.018732162632x2x3－0.05806423034x3x4

此回歸方程相關系數R=0.999994，調整后的相關系數 Ra=0.999972，總體顯著性檢驗值 F=22479.8477，顯著水平達到 p=0.0050，剩余標準差SSE=0.0039，因此該方程的可信度較高。同時根據方程對血紅素得率進行預測，當x1(pH)為4.8，x2(吸附劑添加量)=3.1%，x3(吸附時間)=5h，x4(吸附劑種類)為CMC時，得到y(血紅素純度)的最大預測值為3.13%。

根據回歸分析所得出的上述4個因素的最優值重新組合并進行優化實驗，結果如表6所示。

表6 優化實驗結果(以血紅素得率為指標)

由表6優化實驗結果可知，實測平均值為3.04%，與模型預測值3.13%很接近。通過t檢驗分析可知，t=－1.083 ＜t0.05(4)=2.776，p=0.340，因此，可知實測平均值與模型預測值沒有顯著差異，這進一步說明回歸方程可信度較高。

因此，當以血紅素純度為指標，實驗的最優條件:pH為4.8，吸附劑添加量3.1%(w/v)，吸附時間5h，選用CMC作吸附劑時，血紅素純度可達最大值3.04%(w/v)。

3 結論

確定用CMC－Na完成提取工藝階段的氯化血紅素提取。最佳工藝參數為:以血紅素得率為指標，實驗的最優條件為pH為5.2，吸附劑添加量2.4%，吸附時間8h;以血紅素純度為指標，實驗的最優條件為pH為4.8，吸附劑添加量3.1%，吸附時間5h。整個工藝過程成本低廉，且通過均勻設計準確找出雞血紅素提取的最優工藝，這最終為雞血的綜合深加工開辟一條可行之路。

［1］Autio K，Mietsch F.Heat induced gelation of myofibrillar proteins and sausages:Effect of blood plasma and globin［J］.Journal Food Science，1990，55:1494－1496.

［2］劉任民，范萬東，王搖風，等.豬血中高純度血紅素的提取工藝［J］.現代醫藥衛生，2007，23(18):2687－2689.

［3］李晨光，莊紅，呂學舉，等.動物血液血紅素鐵提取方法研究［J］.食品工業科技，2008(1):308－310.

［4］李秀玲，余蓉，楊繼虞，等.高純度血紅素制備工藝的改進［J］.四川大學學報:醫學版，2004，35(5):738－744.

［5］P K Mandal，V K Rao，B N Kowale，et al.Utilization of Slaughter House Blood in Human Food［J］.Journal Food Science，1999，36(2):91－105.

［6］王光亞.保健食品功效成分檢測方法［M］.北京:中國輕工業出版社，2002:129－131.

Application of uniform design on adsorbing extraction of chicken hemin

OU Zi－bian，WANG Qin*，HE Shu－yi
(College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China)

Objective:The optimal process of adsorbing extraction of chicken hemin was determined by uniform design.Methods:The fresh chicken blood added sodium citrate was used for extracting of heme.The parameters of extraction by pH，adsorbing time，types and additions of sorbent were compared.Results:Index by yield and purity of hemin，the optimal conditions were pH5.2 and 4.8，addition of sorbent were 2.4%and 3.1%，time of sorbent were 8h and 5h，respectively，and both of the type of sorbent was CMC.The yield of hemin was up to 2.848%(w/v)and the purity was 3.04%(w/v).

chicken hemin;uniform design;adsorbing extraction

TS201.2

B

1002－0306(2011)06－0304－03

2010－06－18 *通訊聯系人

區子弁(1985－)，男，在讀研究生，主要從事天然產物的研究與開發。

校創新基金項目(H1409008)。