響應面分析法優化豬骨素提取工藝條件的研究

張 杰，潘風光，劉 婧，李洪山，安曉寧，劉靜波，*

(1.吉林大學營養與功能食品實驗室，吉林長春130062;2.吉林省白城水環境監測中心，吉林白城137000)

響應面分析法優化豬骨素提取工藝條件的研究

張 杰1，2，潘風光1，劉 婧1，李洪山1，安曉寧1，劉靜波1，*

(1.吉林大學營養與功能食品實驗室，吉林長春130062;2.吉林省白城水環境監測中心，吉林白城137000)

利用響應面法對豬骨素的提取工藝進行優化。在單因素實驗基礎上選取主要的實驗因素與水平，根據中心組合(Box－Benhnken)實驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析法，依據回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以提取液中的膠原蛋白含量和游離氨基酸含量的綜合指標為響應值作響應面回歸。在分析各個因素的顯著性和交互作用后，得出豬骨素提取的最佳工藝條件:提取壓力為0.11MPa，時間為226min，液料比為3∶1。在此條件下，實際測得綜合指標含量為0.5339%。

響應面分析，豬骨素，提取工藝條件

我國是畜禽養殖大國，骨資源極為豐富，每年產生的骨頭有近200萬t，且鮮骨中含有豐富的營養物質，被食品和營養學家們譽為“21世紀新型食品”［1］，其蛋白質和脂肪含量與肉類相似，此外，還含有大量的礦物質、維生素等［2］。骨素浸提了鮮骨中的可溶性營養物質，蛋白質(主要是膠原蛋白)含量能達到30%以上［3］，是對骨蛋白的充分利用，體系中還富含游離氨基酸、多肽、核酸等風味物質和鈣、磷、磷脂、雜蛋白、粘多糖等營養成分，易于人體吸收，長期食用安全無毒性，是理想的味精替代品。在豬骨的綜合利用過程中，骨素僅僅是一種中間體，是其它產品的原料。如可以對骨素進行酶解，生產動物水解蛋白(HAP)，也可以利用美拉德反應，生產具有特殊香氣的肉類香精或者加入糖類、醬油、油脂等其它天然的原料，通過加熱調理而制成具有肉香味、燒肉香味等風味的調味料［4］。長期以來，我國大多數的畜禽骨被廢棄或用于加工附加值較低的工業原料和動物飼料(如骨粉)等，造成了極大的環境污染和資源浪費。因此，加大對畜禽骨深加工的開發力度，具有十分重要的意義。在發達國家，從20世紀70年代，日本開始采用現代提取技術加工骨湯，經低溫真空濃縮得到鮮骨抽提物，實現了骨素的工業化生產。因為其來源天然，并且保持了鮮骨中天然的美味和香氣，富有醇厚柔和的口感，很快成為日本人現代調味品的主流，并風靡日本、韓國等亞洲市場［5］。目前國內有多家企業生產骨素，規模較大的有漯河雙匯集團、獨鳳軒等。提高骨素中營養物質(膠原蛋白)和風味物質(呈味游離氨基酸)的含量，優化提取工藝條件，是目前國內的骨素生產企業亟待解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬骨 吉林華正農牧業開發股份有限公司，破碎成2cm左右小塊，蛋白質含量18.96%、脂肪含量10.60%、灰分含量54.09%、水分15.95%;硫酸銅、硫酸鉀、氯化鈉、濃硫酸、甲基紅、溴甲酚綠、甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、考馬斯亮藍G250 均為國產分析純。

ZD－2型自動電位滴定儀 上海雷磁公司;ZDX－35BI座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;AG204電子分析天平(0.1mg～210g) 瑞士METTLER TOLEDO;QSY－16凱氏定氮儀 北京強盛分析儀器設備中心;CXC－06粗纖維測定儀、ZF－06B脂肪測定儀 上海瑞正儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測方法 脂肪的測定:索氏抽提法，GB/T 5009.6－1985;灰分(固形物)含量的測定:550℃灼燒法，GB/T5505－1985;蛋白質含量的測定:凱氏定氮法，GB/T5009.5－2003;膠原蛋白含量的測定:考馬斯亮藍G250法(Coomassive brilliant blue，G－250);游離氨基酸含量的測定:甲醛滴定法［6］。

1.2.2 豬骨素的提取 將鮮骨洗凈，沸水中熱燙2min，以去血去腥，按比例加入蒸餾水，入高壓鍋按不同的壓力和時間提取。

1.2.3 綜合指標的計算 采用將多指標轉化為單一指標的方法對浸提效果進行優化預實驗的研究表明，膠原蛋白和游離氨基酸含量的重要性呈一致性相關，并可用下式進行綜合評價［7］:

綜合指標=X1+X2

式中:X1為膠原蛋白含量(g/100g);X2為游離氨基酸含量(g/100g)。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 提取壓力的影響 分別選擇為0.06、0.08、0.10、0.12、0.14MPa來進行實驗，考察壓力對膠原蛋白含量和游離氨基酸含量的影響，實驗條件:時間3h、液料比3∶1。

1.2.4.2 提取時間的影響 分別選擇為1、2、3、4、5h來進行實驗，考察時間對膠原蛋白含量和游離氨基酸含量的影響，實驗條件:壓力0.12MPa、液料比3∶1。1.2.4.3 液料比的影響 分別選取液料比為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1進行浸提，考察液料比對膠原蛋白含量和游離氨基酸含量的影響，實驗條件:壓力0.12MPa，時間4h。

1.2.5 響應面分析 根據實驗數據，選取骨湯中的膠原蛋白含量(%)和游離氨基酸含量(%)的綜合指標為所考察的響應值。進行壓力(X1，MPa)、時間(X2，h)和液料比(X3)3因素3水平的Box－Behnken實驗設計。對壓力、時間和液料比作如下變換:X1=(P－0.12)/0.02，X2=(t－240)/30，X3=(z－3)/0.5，以三次實驗所得綜合指標的平均值為響應值(Y)，采用design expert軟件對實驗結果進行響應面分析，建立數學模型，進行方差分析，并優化工藝參數。

表1 優化實驗設計的因素水平

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 壓力對膠原蛋白含量和游離氨基酸含量的影響 由圖1可知，隨著壓力的增加，骨湯中的膠原蛋白含量不斷提高，這主要是由于增大浸提壓力能有效軟化骨質，促進骨中營養物質的溶出，但0.12MPa之后，蛋白質含量變化趨于平緩。而游離氨基酸含量呈先升后微降的趨勢，0.12MPa時達到最大，可見壓力過高，氨基酸的溶出量達到最大值后，繼續增大壓力不僅浪費能源還可能會在一定程度上破壞骨湯中的呈味氨基酸，導致氨基酸含量不升反降。綜合以上分析，在優化實驗中選取0.10、0.12、0.14MPa作為浸提壓力的實驗水平。

圖1 浸提壓力對膠原蛋白和游離氨基酸含量的影響

2.1.2 時間對膠原蛋白含量和游離氨基酸含量的影響 由圖2可知，隨著提取時間的增加，骨湯中膠原蛋白含量和游離氨基酸含量不斷升高，但4h之后，隨著時間的增加，膠原蛋白和游離氨基酸含量趨于平緩，這主要是由于隨著浸提時間的增加，骨中營養物質的溶出量也在增加，當浸提時間足夠長時，營養物質已基本溶出。因此在優化實驗中選取210、240、270min作為浸提時間的實驗水平。

圖2 浸提時間對膠原蛋白和游離氨基酸含量的影響

2.1.3 液料比對膠原蛋白含量和游離氨基酸含量的影響 由圖3可知，隨著液料比的增加，骨湯中膠原蛋白含量和游離氨基酸含量呈逐漸下降的趨勢，加水量過多，骨湯中膠原蛋白和游離氨基酸含量降低，絕對量升高，但液料比過大會給濃縮過程帶來負擔;加水量過少則不利于原料中的營養物質和風味成分浸出，絕對浸出少。因此在優化實驗中選取2∶1、3∶1、4∶1作為液料比的實驗水平。

圖3 液料比對膠原蛋白和游離氨基酸含量的影響

2.2 響應面分析以及提取工藝的優化

2.2.1 骨素提取工藝優化實驗設計及結果 以膠原蛋白含量和游離氨基酸含量指標作為響應值，采用響應面回歸(RSREG)進行數據分析［8］。骨素提取優化實驗設計及實驗結果見表2，分析結果見表3。

表3 綜合指標回歸方程的方差分析

表2 響應面實驗結果

2.2.2 數學模型的建立及方差分析 以膠原蛋白和游離氨基酸含量的綜合指標為響應值，經過回歸擬合后的二次多項回歸方程為:Y=0.53+0.026X1+7.250E －0.03X2－3.450E －0.03X3+1.825E －并對該模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，回歸方程的失擬檢驗p=0.2335>0.1，差異不顯著，總回歸方程 F檢驗p＜0.0001，差異極顯著，說明該模型與實際實驗擬合較好，可以用于豬骨素生產中提取工藝蛋白質和游離氨基酸含量綜合指標的理論預測，方程一次項的影響中X1、X2和X3的p＜0.01(差異極顯著);二次項的影響中的p值＜0.01，差異極顯著的p=0.0539，差異較顯著，X1X2的交互作用p=0.2840>0.1，差異不顯著，X1X3、X2X3的交互作用p＜0.01，差異極顯著。由于模型的p＜0.01，因此該方程的回歸模型差異極顯著。從回歸系數的大小可以看出，壓力對骨湯中蛋白質和氨基酸含量的綜合指標影響最大，其次是時間，液料比的影響最小。相關系數R2=0.9381，說明響應值的變化有93.81%來源于所選變量。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

2.2.3 響應面直觀分析 響應曲面分析(RSM)的圖形是特定的響應值Y對應自變量構成的一個三維空間圖，可以直觀地反映出各自變量對響應變量的影響［9－10］。

以綜合指標為響應指標值，對壓力、時間和液料比3個因素進行響應面分析，其響應面圖結果見圖4～圖6。

圖4 Z=f(X1，X2)的響應面圖

圖5 Z=f(X1，X3)的響應面圖

由圖4～圖6可以看出，壓力、時間和液料比3個因素對綜合指標的影響程度在切面上都呈拋物線趨勢，二者之間有明顯的交互作用，由響應面圖以及相應圖譜分析可知，壓力對骨湯中蛋白質和游離氨基酸含量綜合指標的影響最大，其次是時間，液料比的影響最小。

2.2.4 最佳條件的優化與驗證 對回歸方程取一階偏導數等于零，整理可得如下三式:

圖6 Z=f(X2，X3)的響應面圖

式(1)～式(3)聯立方程組，解得X1=－0.4226，X2=－0.4617，X3=0，代入前述的變換公式得到提取壓力為0.11MPa，時間為226min，液料比為3∶1，在此條件下，實際測得綜合指標含量為0.5339%，回歸模型預測含量理論值可達0.5346%，實際測定值與理論預測值無顯著差異。

3 結論

通過單因素實驗，以及在此基礎上采用三因素三水平響應面法實驗，建立了響應值與各因素之間的數學模型，依此模型可以預測理論提取率。根據此二次回歸模型，確定豬骨素提取工藝的最佳參數:提取壓力為0.11MPa，時間為226min，液料比為3∶1，實際測得綜合指標含量為0.5339%，在此條件得到高蛋白質和游離氨基酸含量的骨素，可用于水解動物蛋白的生產及進一步加工成調味料和肉味香精，回歸模型預測含量理論值可達0.5346%，與實際測定值無顯著差異，建立的數學模型能很好地預測各因素同綜合指標含量之間的關系，對優化豬骨素提取工藝、提高企業生產效率有一定的指導意義。

［1］王衛，張志宇，劉達玉，等.畜禽骨加工利用及其產品開發［J］.食品科技，2009，34(5):154－158.

［2］任紅敏，劉曉宇，陳翊平，畜禽骨的研究現狀和發展前景［J］.農產品加工學刊，2008(4):35－37.

［3］Contantions G Z，et al.Assessment of the Protein Quality of Bone Isolates for Use an Ingredient in Meet and Poultry Products［J］.Agri Food Chem，1995，43:77－83.

［4］張留安，呂永林.骨抽出物發展方向探討［J］.肉類工業，2005(12):42－43.

［5］夏秀芳.骨素及應用［J］.肉類工業，2007(7):22－25.

［6］侯曼玲主編.食品分析［M］.化學工業出版社，2005.

［7］馬麗珍，文旭娟，梁鵬.羊骨不同前處理條件對骨渣及骨湯中有效成分的影響［J］.天津農學院學報，2006(4):141－143.

［8］Wettasinghe M，Shahidi F.Antioxidant and free radical scavenging properties of ethanol extracts of defatted borage(Borago officinalis L)seeds［J］.Food Chemistry，1999，67:399－414.

［9］劉靜波，林松毅，李秋杰.中心組合設計法優化超聲波提取啤酒糟中木糖的技術研究［J］.釀酒科技，2009，182(8):115－119.

［10］李亞娜，林永成，佘志剛.響應面分析法優化羊棲菜多糖的提取工藝［J］.華南理工大學學報:自然科學版，2004，32(11):29－31.

Optimization of extraction technology conditions of swine bone extract using response surface methodology(RSM)

ZHANG Jie1，2，PAN Feng－guang1，LIU Jing1，LI Hong－shan1，AN Xiao－ning1，LIU Jing－Bo1，*
(1.Laboratory of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，China;2.China Water Environmental Monitoring Center of Baicheng City，Baicheng 137000，China)

Based on single factor tests，the optimum extraction conditions of swine bone extraction were obtained through Box－Benhnken central combination design and RSM.The results showed that the optimum extraction conditions of comprehensive index on contents of collagen protein and ammonia nitrogen in bone soup were as follows:extraction pressure 0.11MPa，extraction time 226min，ratio of water to bone 3∶1.Under this condition，the comprehensive index on contents of collagen protein and ammonia nitrogen was 0.5339%.

response surface methodology;pig swine bone;extraction technology conditions

TS201.1

B

1002－0306(2011)06－0286－04

2010－05－04 *通訊聯系人

張杰(1982－)，女，碩士生，助理工程師，研究方向:營養與功能食品。

長春市科技支撐計劃畜禽產品專項(08KZ26)。