高效分離純化藻藍蛋白新法

廖曉霞，張學武

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

高效分離純化藻藍蛋白新法

廖曉霞，張學武

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

采用殼聚糖親和沉淀－活性炭吸附－DEAE Sephadex A－25柱層析三步法分離純化藻藍蛋白，與傳統方法相比具有成本低、耗時短、操作便捷等優點。殼聚糖和活性炭結合使用，可使藻藍蛋白純度(A620/A280)由0.93提高至2.78。通過DEAE Sephadex A－25葡聚糖凝膠柱層析后，可得到高純度藻藍蛋白，純度達4.3。純化后的藻藍蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)鑒定，產生分子量分別為16.5ku和17.6ku的α，β亞基條帶。吸收光譜和熒光發射光譜掃描表明所得蛋白在620、643nm分別具有藻藍蛋白特征吸收峰和熒光發射峰。

藻藍蛋白，殼聚糖，活性炭，純化

藻藍蛋白(PC)是一種普遍存在于藍藻和螺旋藻細胞內的捕光色素蛋白，在螺旋藻中的含量高達7%～20%，在光合作用中能以近乎100%的高效率將光能優先傳遞給光系統［1］。藻藍蛋白不僅在光合作用的原初反應機理的探索方面有重要意義，而且還可以作為熒光分子探針應用于生物醫學研究，作為無毒副作用的天然色素蛋白，可取代合成染料應用于食品、化妝品以及醫藥中。有研究表明，藻藍蛋白具有抗腫瘤活性，可提高免疫機能，其特性受到了國內外的重視，并已應用于老年癡呆癥和帕金森癥的治療［2－4］。雖然藻藍蛋白具有十分廣闊的應用前景，但由于其分離純化步驟繁瑣，造成藻藍蛋白商品價格昂貴，其應用受到了一定限制。藻藍蛋白純化過程的費用約占其成本的50%～90%［4］，因此，解決問題的關鍵在于純化方法的簡化和高效性。傳統的藻藍蛋白純化方法包括兩大部分，首先進行細胞裂解以獲取粗提物，常用超聲、反復凍融、酶解和高壓均質等方法。然后將硫酸銨沉淀法與多種色譜層析法(如羥基磷灰石柱、離子交換色譜、分子排阻色潽等)結合使用，達到分離純化藻藍蛋白的目的。傳統方法的主要缺陷在于:a.采用超聲或高壓均質等機械法處理藻粉，能耗高;b.硫酸銨一步或多步沉淀蛋白法常需要1～2d的時間，而且容易造成蛋白變性，使目標蛋白損失率增大;c.傳統方法常需要多步色譜純化步驟，才能獲取高純度藻藍蛋白，不僅耗時長，而且因色譜填料的昂貴造成純化成本的驟增。近年來，涌現出一些取代傳統方法的新工藝，比如雙水相萃取技術。但雙水相萃取法所用的聚乙二醇PEG與藻藍蛋白可穩定結合，目前將藻藍蛋白與PEG完全分離仍存在一定困難［5］。為了開發一種簡單、高效的高純度藻藍蛋白分離方法，文中選取價格低廉、原料易得的殼聚糖及活性炭處理藻藍蛋白粗提液，嘗試用一步DEAE－Sephadex A－25柱層析法，制備高純度的藻藍蛋白。本方法為藻藍蛋白的純化技術提供了新思路，有助于促進我國藻藍蛋白的規?；_發利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻粉 江門粵健生物工程有限公司;水溶性殼聚糖 浙江澳興生物科技有限公司;活性炭

廣州清宇活性炭公司;DEAE－Sephadex A－25 美國Pharmacia公司。

紫外可見分光光度計 日本島津公司;自動分部收集器 上海滬西儀器廠;冷凍離心機 美國PE公司;熒光分光光度計 日本Hitachi公司;30ku超濾管 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻藍蛋白粗提液制備 稱取1g螺旋藻粉，用去離子水洗滌3～5min，加入15mL 100mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)，攪拌浸泡2h，浸提液以8000r/min冷凍離心8min，收集藍色上清液。

1.2.2 藻藍蛋白純化 向藻藍蛋白粗提液中加入一定量2%(w/v)的殼聚糖溶液，調節pH至6.9，攪拌5min，離心棄去沉淀，向清液中加入一定量活性炭攪拌5min，離心取上清液。上清液用30ku超濾管超濾濃縮，濃縮液用適量10mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8，含0.1mol/L氯化鈉)溶解，再用超濾管超濾濃縮至一定體積以備柱層析使用。用10mmol/L磷酸鉀緩沖液(含0.1mol/L氯化鈉)預平衡DEAESephadex A－25層析柱，上樣，以10mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8，含0.1～0.3mol/L氯化鈉)梯度洗脫，流速為0.7mL/min，每3min收集1管，測定每管在280、620nm處的吸收值。

1.2.3 藻藍蛋白光譜分析 用UV－2450分光光度計進行吸收光譜全波長掃描，F－4500熒光分光光度計掃描熒光光譜。

1.2.4 SDS－PAGE電泳 采用垂直板不連續電泳系統，分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。樣品在濃縮膠中電泳電壓為80V，進入分離膠后電壓為120V;剝膠后，以0.1%考馬斯亮藍R－250染色，用含30%甲醇的10%乙酸脫色。

1.2.5 藻藍蛋白得率和純度測定方法 根據Alka等［4］采用的方法測定藻藍蛋白含量:［PC］=(A620－0.7A650)/7.38;藻藍蛋白得率(Y)計算方法:Y=［PC］a×Va×100/(［PC］b×Vb);藻藍蛋白純度以A620/A280表示;式中:［PC］代表藻藍蛋白的濃度(mg/mL)，A620、A650分別代表藻藍蛋白溶液在 620、650nm處的吸光度，a、b分別代表所進行的純化步驟所得藻藍蛋白溶液和藻藍蛋白粗提液，V代表溶液體積。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖親和沉淀條件的優化

殼聚糖由于末端氨基質子化，是一種對pH相當敏感的聚合物，在pH小于6.5時可溶解，但pH大于6.5時，殼聚糖能與一般帶負電荷的蛋白質產生較強的吸附作用而沉淀［6］，可以通過調節pH使殼聚糖與雜質蛋白親和沉淀，進而達到分離純化目的蛋白的最佳效果。溶液的pH及殼聚糖加入量的控制是殼聚糖親和沉淀純化藻藍蛋白的關鍵，因此有必要對親和沉淀條件進行摸索和優化。由圖1可知，在藻藍蛋白粗提液中加入0.33%(w/w)殼聚糖時，調節溶液pH至6.9，就可有效純化藻藍蛋白，純度由0.93提高至1.3，而藻藍蛋白的得率可達95%。當pH>6.9時，藻藍蛋白純度和得率均有下降趨勢，溶液顏色也由亮藍色逐漸轉為較灰暗的藍色。殼聚糖與蛋白質之間主要是靜電作用，即根據它們酸堿性、極性的差異，通過離子間的吸附和脫吸附而將電解質各組分分開［7］。溶液pH越高，殼聚糖與蛋白質之間的吸附作用越強烈，此時選擇性吸附越差。當pH為6.9時，殼聚糖與一部分雜質蛋白吸附沉淀，而與藻藍蛋白之間的靜電作用較弱，使大部分藻藍蛋白仍保留在溶液中，從而起到純化的作用。由圖2可知，溶液pH為6.9時，僅加入0.29%的殼聚糖，就可達到提高藻藍蛋白純度的效果，純度可由粗提液的0.93提高至1.52，而藻藍蛋白的得率仍可維持在90%以上。因此，要根據所純化的目標物來確定pH和殼聚糖加入量。與傳統的硫酸沉淀法相比，殼聚糖沉淀法耗時短，只需幾分鐘即可達到與硫酸銨法［8］相當的效果，而且產品得率高，條件溫和，不易造成蛋白質變性。

圖1 pH對藻藍蛋白純度和得率的影響注:殼聚糖濃度0.33%(w/w)。

2.2 活性炭吸附條件的優化

活性炭(粉炭)有巨大的比表面積，其成本低，使用方法簡單，且不會影響提取物的生物活性。目前，國內使用活性炭進行脫色、除味等方面的報道較多，而用活性炭純化藻藍蛋白的研究未見報道。由于活性炭具有很強的吸附能力，處理條件的不同，對純化效果及產品回收率具有較大影響。實驗中發現用活性炭處理藻藍蛋白粗提液5min，即可達到純化藻藍蛋白的效果，而延長處理時間，不但不能使純度進一步提高，反而對藻藍蛋白的得率影響較大，因此本實驗選擇活性炭處理時間為5min，并進一步確定活性炭加入量對純化效果的影響。由圖3可知，隨著活性炭加入量的增加，藻藍蛋白純度可達到一個最大值，而蛋白得率則逐漸下降。綜合考慮得率和純度兩個因素，確定最佳活性炭加入量為80g/L，此時藻藍蛋白純度可由1.52提高至2.7，得率為85%?；钚蕴课娇梢猿ド丶安糠值头肿恿康鞍?，所得溶液為清亮的藍色，為進一步提高藻藍蛋白純度奠定基礎。與DEAE－52纖維素柱層析法［9］相比，純化效果相當，但該法具有成本低、操作簡便快捷、產品回收率高等優勢。

圖3 活性炭濃度對藻藍蛋白純度和得率的影響

2.3 DEAE－Sephadex A－25柱層析分離

DEAE－Sephadex系列柱料是研究者常采用的純化藻藍蛋白的填料之一，但一般需要多種色譜串聯使用，才能獲得高純度藻藍蛋白［10－11］。采用上述所確定的最佳條件純化藻藍蛋白，所得藻藍蛋白純度為2.78。將所得蛋白溶液超濾濃縮至一定體積，上樣后，以磷酸鉀緩沖液洗脫，結果見圖4。經紫外可見分光光度計檢測發現，目標組分藻藍蛋白主要集中在第一洗脫峰，第二洗脫峰主要為別藻藍蛋白，同時含有少量藻藍蛋白。合并A620/A280>4.0的洗脫液，超濾管濃縮脫鹽后，紫外可見分光光度計檢測表明所得藻藍蛋白純度(A620/A280)為4.3，符合國際認可的高純度藻藍蛋白要求［12］(A620/A280>4.0)。由此可見，經過殼聚糖沉淀和活性炭吸附后，一步色譜法即可獲得高純度藻藍蛋白，減少了色譜填料的費用。與純化藻藍蛋白常用的羥基磷灰石吸附技術相比，DEAE－Sephadex A－25色譜法具有流速快、回收率高等優點。此外，因藻藍蛋白在第一洗脫峰即能夠分離出，可以節省洗脫時間，提高純化效率。

圖4 藻藍蛋白經DEAE Sephadex A－25凝膠層析洗脫曲線

2.4 藻藍蛋白光譜特性

由圖5可知，純化后的藻藍蛋白在620、348、280nm附近有特征吸收峰，在620nm處有藻藍蛋白的最大特征吸收峰。280nm處的吸收峰為蛋白中芳香族氨基酸的吸收，一般由酪氨酸和色氨酸殘基的苯環引起的光吸收，360nm處的較弱吸收峰可能是來自蛋白中二硫鍵的光吸收。如果藻藍蛋白變性，其熒光會減弱或消失，因此把熒光光譜作為鑒定藻藍蛋白活性的指標之一。由圖6可知，在643nm處有藻藍蛋白特征熒光發射峰(激發波長為590nm)，與國內外文獻報道一致［13－14］，可見分離得到了具有活性的藻藍蛋白。

2.5 SDS－PAGE電泳

將純化各步驟所得的藻藍蛋白進行SDS－PAGE電泳，由圖7可知，經殼聚糖和活性炭處理后，雜質蛋白逐漸被除去，經過DEAE Sephadex A－25柱層析分離后的藻藍蛋白可達到電泳級別純度，藻藍蛋白樣品在14ku和20ku之間出現兩條帶，與文獻報道符合［15］，為α和β亞基，大小分別為16.5ku和17.6ku。

圖5 純化后藻藍蛋白的紫外－可見吸收光譜圖

圖6 純化后藻藍蛋白的熒光發射光譜圖

圖7 SDS－PAGE電泳圖

3 結論

針對當前藻藍蛋白純化成本高和商品價格貴的現狀，開發出一套高效簡便的藻藍蛋白純化技術。本方法主要操作參數為:藻藍蛋白粗提液中加入0.29%殼聚糖，調節pH至6.9，攪拌5min后，離心棄沉淀，向上清液中加入80g/L活性炭吸附5min，離心，超濾濃縮上清液，采用DEAE Sephadex A－25柱層析法，以10mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)+0.1～0.3mol/L氯化鈉梯度洗脫得高純度藻藍蛋白(純度達4.3)。與傳統方法相比，殼聚糖親和沉淀－活性炭吸附－DEAE Sephadex A－25柱層析法具有五個優點:a.純化步驟少，前處理簡便;b.能耗小，無需超聲破碎及高壓均質;c.成本低，所用活性炭和殼聚糖價格便宜，一步色譜法減少了填料成本;d.耗時短，無需硫酸銨沉淀步驟，整個過程只需2d即可完成;e.操作簡便，具有規?；瘧玫臐摿?。

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New method for efficient separation and purification of C－phycocyanin

LIAO Xiao－xia，ZHANG Xue－wu
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

An efficient method was developed for the purification of C－phycocyanin(C－PC)，which involved three steps:chitosan affinity precipitation，activated charcoal absorption and DEAE Sephadex A－25 chromatography.As compared with conventional methods，this method was cheap，time－saving and easy to operate.The purity(A620/A280)of C－phycocyanin obtained after chitosan－activated charcoal treatment was increased from 0.93 to 2.78，which could be improved to 4.3 after being subjected to DEAE Sephadex A－25 chromatography.Analyzed by SDS－PAGE electrophoresis，phycocyanin migrated as two bands corresponding to its two subunits(α and β)and the molecular weights were 16.5ku and 17.6ku，respectively.The absorption spectra and fluorescence emission specra of purified protein showed peaks at 620nm and 643nm，respectively，which was characteristic of C－phycocyanin.

C－phycocyanin;chitosan;activated charcoal;purification

TS254.1

B

1002－0306(2011)06－0273－04

2010－06－03

廖曉霞(1986－)，女，碩士，研究方向:天然活性蛋白質研究?；痦椖?廣東省教育部產學研結合項目(2009B090300271)。