堿提酸沉法提取紫花苜蓿干草葉蛋白初探

許英一，李 紅，楊偉光，任 健，王曉杰

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾161006;2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾大學農產品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006;3.黑龍江省畜牧研究所牧草育種室，黑龍江齊齊哈爾161000)

堿提酸沉法提取紫花苜蓿干草葉蛋白初探

許英一1，2，李 紅3，楊偉光3，任 健1，2，王曉杰1，2

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾161006;2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾大學農產品加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006;3.黑龍江省畜牧研究所牧草育種室，黑龍江齊齊哈爾161000)

以北方寒冷地區紫花苜蓿干草為材料，將苜蓿干草粉碎后，采用堿提酸沉法提取苜蓿葉蛋白，并對提取的葉蛋白進行氨基酸含量的測定分析。本實驗設計了料水比、pH、攪拌時間三個單因素進行堿提實驗，并在單因素基礎上設計了正交實驗。正交實驗結果表明，堿提法的最佳工藝條件為:料水比為1∶35，pH為10，攪拌時間為12min。在最佳堿提實驗的基礎上進行酸沉，通過單因素實驗，確定酸沉的最佳條件為提取液pH=4.2。此時樣品粗蛋白含量為59.76%，粗蛋白提取率為42.52%。通過氨基酸分析結果表明，苜蓿葉蛋白氨基酸種類齊全，含量高，氨基酸比例協調，因此苜蓿葉蛋白是優質蛋白質。

苜蓿，葉蛋白，堿提酸沉，氨基酸

目前，發展中國家都面臨著蛋白質危機。據統計，我國每年短缺2000t［1］。苜蓿乃“牧草之王”，產量大，價格低廉，其粗提物－葉蛋白不僅蛋白質含量高，包含人和動物全部必需氨基酸和一些稀有氨基酸，而且富含胡蘿卜素、多種維生素和微量元素，營養豐富且有降血壓、血脂及膽固醇等多種生理功能，將其開發為保健品原料前景誘人，具有潛在的經濟效益和社會效益［2］(如推動飼料工業、畜牧業和食品工業的發展，帶動飲食結構的改變等)。本實驗采用堿提酸沉法對苜蓿干草葉蛋白的最佳提取工藝進行了研究，同時對苜蓿葉蛋白粉進行氨基酸分析，以期為苜蓿葉蛋白的應用開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫花苜蓿干草 黑龍江省畜牧研究所提供;氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、無水碳酸鈉、硼酸、無水乙醇 均為分析純。

FW－80型微型高速萬能試樣粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;80－1臺式低速離心機 江蘇省金壇市醫療儀器廠;SHB－3循環水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠;HH－4數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司;124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;SXCL－4型加熱磁力攪拌器 鄭州佳創儀器設備有限公司;722N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;PHS－25(數顯)pH計 上海精密科學儀器有限公司;FD－1真空冷凍干燥機上海豫康科教儀器設備有限公司;L－8900全自動氨基酸分析儀 日本日立高新技術株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

1.2.1.1 苜蓿葉蛋白堿提的工藝條件優化 根據蛋白質的絮凝特性，實驗著重考察料水比、pH、攪拌時間三個主要影響因素。在單因素實驗的基礎上，選用L9(34)正交實驗設計對堿提苜蓿葉蛋白的工藝條件進行優化。因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.1.2 苜蓿葉蛋白酸沉的工藝條件優化 采用苜蓿葉蛋白堿提的最優工藝條件提取蛋白質上清液，分別用0.01mol/L HCl緩慢調其pH至2.0、3.0、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.5、6.0，于 70℃ 水浴8min，離心，測定沉淀前后上清液中蛋白質的含量，計算苜蓿葉蛋白的沉淀率。

1.2.1.3 氨基酸含量分析 采用氨基酸全自動分析儀(日立L－8900型)測定。

1.2.2 葉蛋白的提取方法 工藝流程:

1.2.3 測定方法 蛋白質含量測定采用微量凱氏定氮法［3］。

氨基酸分析:采用氨基酸全自動分析儀(日立L－8900型)測定，樣品處理經6mol/L HCl 105℃水解24h，測定苜蓿干草和粗蛋白含量最高的葉蛋白提取物中的17種氨基酸含量。

1.2.4 計算公式 粗蛋白提取率(%)=提取液中粗蛋白的含量/試樣中粗蛋白的含量×100%

沉淀率(%)=(酸沉前上清液中粗蛋白的含量－酸沉后上清液中粗蛋白的含量)/酸沉前上清液中粗蛋白的含量×100%

2 結果與分析

2.1 苜蓿葉蛋白堿提的工藝條件優化

由表2極差分析結果可得出，按照極差R的大小，影響粗蛋白提取率的主次因素的順序為A(料水比)>C(攪拌時間)>B(pH)，通過正交實驗確定最佳組合為A3B2C3，即料水比為1∶35，pH為10，攪拌時間為12min。由方差分析表3可知，料水比對粗蛋白提取率顯著影響(α=0.05)，其次是攪拌時間，pH對粗蛋白提取率影響最小，這與極差分析的結果一致。由粗蛋白提取率大小還可以看出，正交表中直觀表現最佳組合為A2B2C3，與正交結果不符，進行驗證實驗后得出，組合A3B2C3的粗蛋白提取率為42.52%，大于A2B2C3的粗蛋白提取率，說明通過正交實驗能夠得到最佳的實驗組合。

表2 苜蓿葉蛋白堿提的正交實驗結果與極差分析

表3 正交實驗方差分析

2.2 苜蓿葉蛋白酸沉的工藝條件優化

由圖1可知，pH為4.2時的沉淀率最高，因此我們選用蛋白質酸沉淀時的pH為4.2。

圖1 pH對苜蓿葉蛋白沉淀效果的影響

2.3 氨基酸分析

根據測定(見表4和表5)，苜蓿葉蛋白氨基酸種類齊全，含量高，氨基酸比例協調，是一種高效的植物蛋白飼料。

由表5可知，苜蓿葉蛋白中必需氨基酸的含量豐富，必需氨基酸含量占氨基酸總含量的46.58%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.87，將苜蓿葉蛋白濃縮物中的必需氨基酸含量占氨基酸總含量的比值與國際通用FAO/WHO標準對比分析，其必須氨基酸含量均高于FAO/WHO標準，必需氨基酸含量占氨基酸總含量的百分比和必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值分別高于FAO/WHO標準規定的40%和0.6［4］。因此苜蓿葉蛋白可以提供優質蛋白質。

表4 苜蓿葉蛋白濃縮物中非必需氨基酸含量(%)

表5 苜蓿葉蛋白中必需氨基酸的含量

3 結論與討論

3.1 本研究采用堿提酸沉法確定了苜蓿干草葉蛋白堿提的最佳工藝條件為:料水比為1∶35，pH為10，攪拌時間為12min。酸沉的最佳條件為提取液pH=4.2。此時樣品粗蛋白含量為59.76%，粗蛋白提取率為42.52%。

3.2 通過氨基酸分析結果表明，苜蓿葉蛋白中必需氨基酸的含量豐富，必需氨基酸含量占氨基酸總含量的46.58%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.87，分別高于FAO/WHO標準規定的40%和0.6 。因此苜蓿葉蛋白可以提供優質蛋白質。

3.3 苜蓿提取完后，剩余的棕色液化學成分的分析，以及草渣等最優利用問題，尚需進一步研究。

［1］閻娥，范月君，謝春花.苜蓿葉蛋白提取效果及葉蛋白氨基酸組成的研究［J］.青海師范大學學報，2006(1):66－68.

［2］李明元，文李鈴，杜小琴.可食苜蓿葉蛋白提取工藝研究［J］.西南師范大學學報，2008，30(3):69－72.

［3］張水華.食品分析［M］.北京:中國輕工業出版社，2007:159－160.

［4］FAO/WHO.Energy and protein requirements.FAO Nutrition Meeting Report series［J］.Roma:FAO，1793:52－63.

Study on preparation of leaf protein from alfalfa hay by alkali extraction and acid precipitation

XU Ying－yi1，2，LI Hong3，YANG Wei－guang3，REN Jian1，2，WANG Xiao－jie1，2
(1.College of Food and Biotechnology，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;3.Technical Office of Forage Breeding，Institute of Animal Husbandry of Heilongjiang Province，Qiqihar 161000，China)

Based on alfalfa hay in northern cold areas as experiment material，alfalfa hay was crushed，leaf protein was extracted by alkaline extraction and acid precipitation，and the content of amino acid was analyzed.Three single factors such as feed water ratio，pH value and stirring time in alkaline extraction experiment were designed.Through orthogonal test，the results show the optimal conditions for alkaline extraction were as follows:feed water ratio of 1∶35，pH value of 10，stirring time for 12 minutes.On the basis of the best alkaline extraction experiment，through single－factor experiments，the best condition for acid precipitation was pH4.2.Crude protein content of samples was 59.76%，extracting rate of soluble protein was 42.52%.Amino acids analysis was employed，the results showed that the type of amino acids in leaf protein from alfalfa was complete，high content，and the proportion coordination of amino acids.Therefore，leaf protein from alfalfa is a kind of high quality protein.

alfalfa;leaf protein;alkali extraction and acid precipitation;amino acids

TS201.2+1

B

1002－0306(2011)06－0264－03

2010－03－09

許英一(1971－)，女，副教授，碩士，主要從事食品教學與研究工作。

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(11541403)。