發酵玉米黃漿水與廢糖蜜生產單細胞蛋白的菌種生長特性研究

李小雨，馬 鶯，王 璐

(哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090)

發酵玉米黃漿水與廢糖蜜生產單細胞蛋白的菌種生長特性研究

李小雨，馬 鶯，王 璐

(哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090)

通過對玉米提取結晶糖后的黃漿水與糖蜜中粗蛋白、非蛋白氮、總糖、還原糖、磷、水分、粗灰分、葉黃素、礦物質元素成分的分析，選擇產朊假絲酵母(Candida utilis)、白地霉(Geotrichum candidum)和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)3種常見的工業酵母菌，通過對黃漿水與糖蜜混合液搖瓶發酵生產單細胞蛋白，研究三種酵母的生長特性，并篩選最佳的發酵菌種的組合。結果表明，當白地霉與熱帶假絲酵母兩菌種等量混合發酵時，所得的單細胞蛋白干物質重量最大為5.87g，其中蛋白含量高達1.78g/100mL。

黃漿水，糖蜜，單細胞蛋白，篩選

我國是玉米的主要生產國之一，全國用玉米生產淀粉糖的廠家有數千個，其下腳料大多未被合理利用。據調查，一個生產3000t淀粉糖的廠家，排放的下腳料高達1500t。在淀粉糖廠，這些廢料因缺乏適當的處理和長期放置而發霉變臭，嚴重污染了環境并造成了國家資源的浪費。另外，有的制糖廠在生產淀粉糖后，下腳料直接用于飼養動物，其經濟效益非常低，并且動物食用后營養吸收不是很好，特別是玉米中的纖維素等物質不易消化吸收。本研究主要利用多菌種對玉米糖廠提取結晶糖后，所廢棄的黃漿水和廢糖蜜進行發酵，將其轉化成利益巨大的單細胞蛋白飼料［1］。本文主要對黃漿水與廢糖蜜中所包含的主要成分進行分析，明確其營養成分，并第一次將黃漿水與糖蜜混合液作為發酵原料;其次分別對3種工業酵母的生長特性進行研究，并利用三種酵母以不同組合方式進行發酵，篩選出優良的發酵菌種進行單細胞蛋白生產，從而在一定程度上解決資源浪費和環境污染等問題［2］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產朊假絲酵母 (Candida utilis)、白地霉(Geotrichum candidum)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) 由黑龍江省微生物研究所提供;實驗所用黃漿水與糖蜜 取自牡丹江制糖企業;麥芽汁培養基 10°Bx的麥芽汁;發酵培養基 黃漿水與糖蜜之比為1∶1的發酵液，pH自然，121℃滅菌15min［3］;尿素、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、次甲基藍、甲基紅、鉬酸銨、偏釩酸銨、磷酸二氫鉀、蒽酮、硫脲、葡萄糖、酒石酸鉀、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硝酸 均為分析純。

HYA恒溫搖床，TH－CB－401超凈臺，HG303－5電熱恒溫培養箱，pHs－3TC精密數顯酸度計，XSP－18A光學顯微鏡，LIBROR.EB－280電子天平，YXQ－5G41280電熱手提式壓力蒸汽消毒器，血球計數板，SK－1型快速混勻器，721型分光光度計，原子吸收光譜儀，凱氏定氮儀，高溫爐，可調電熱爐，101－1－Bs電熱恒溫鼓風干燥器，星輝GL－10ML離心機。

表1 黃漿水與糖蜜的組成成分(%)

表2 黃漿水中所含的礦物質元素組成成分(%)

1.2 測定方法

1.2.1 粗蛋白的測定 凱氏定氮法［4］。

1.2.2 真蛋白的測定 三氯乙酸沉降法、凱氏定氮法［5］。

1.2.3 總糖的測定 蒽酮硫酸法［6］。

1.2.4 還原糖的測定 直接滴定法［7］。

1.2.5 磷的測定 分光光度法［8］。

1.2.6 葉黃素的測定 分光光度法［9］。

1.2.7 粗灰分的測定 直接灼燒法［10］。

1.2.8 水分的測定 恒重蒸發法。

1.2.9 礦物質元素的測定 原子吸收光譜［11］。

1.3 菌種的篩選

1.3.1 菌種種子液的制備

1.3.1.1 菌種活化 分別挑取保藏于冰箱中的3種斜面酵母菌種，接種于麥芽汁液體培養基(10°Bx)中，在30℃，180r/min搖床培養箱中振蕩培養72h，傳代，備用。

1.3.1.2 種子液的制備 從麥芽汁液體培養基中以2%的接種量接種于裝有50mL麥芽汁培養基的100mL三角瓶中，30℃，180r/min振蕩培養 72h，備用。

1.3.1.3 菌數的測定 從培養72h的種子液中無菌操作取出1mL種子液，利用血球板計數法在顯微鏡下測出種子液菌數的濃度［12］。

1.3.2 生長曲線的測定 a.分別以10%的總接種量接種三種酵母濃度為 107個/mL種子液于裝有100mL發酵培養基的500mL三角瓶中，30℃，180r/min搖床培養。b.每隔4h取發酵液在4000r/min離心15min，烘干，測其干物質重量;每隔8h測其粗蛋白含量。c.分別繪制三種酵母的干物質重量變化曲線和粗蛋白含量變化曲線。

1.3.3 菌種的發酵篩選 a.分別將產朊假絲酵母、白地霉、熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母∶白地霉(1∶1)、產朊假絲酵母∶熱帶假絲酵母(1∶1)、白地霉∶熱帶假絲酵母(1∶1)、產朊假絲酵母∶白地霉∶熱帶假絲酵母(1∶1∶1)的菌種組合以總濃度為107個/mL的接種液接種到100mL發酵培養基中，30℃，180r/min搖床培養到其最大生長量［13］。b.發酵培養后取發酵液在4000r/min離心15min，烘干，測其干物質重量。c.取適量的烘干后的單細胞蛋白飼料，利用凱氏定氮法測其粗蛋白含量。

2 結果與討論

2.1 原料分析

通過對黃漿水和糖蜜中的粗蛋白、總糖、還原糖、水分、粗灰分、葉黃素的含量進行測定，如表1所示。

對原料中的含磷量、非蛋白氮的含量以及礦物質元素的含量進行檢測，如表2所示。

實驗結果表明，原料中的碳源、氮源、礦物質元素以及微量元素進行檢測分析得出玉米黃漿水與糖蜜的混合液中:玉米黃漿水的水分含量高達90.55%，碳源基本上為0、葉黃素含量為0.1366%占干重，粗蛋白含量幾乎沒有，而礦物質元素含量比較豐富，足夠酵母細胞正常生長利用;糖蜜中含有豐富的碳源，總糖含量高達49.38%，還原糖含量為16.21%，而氮源、促生長因子等含量幾乎為0。玉米黃漿水中含有豐富的礦物質元素以及一些促生長因子，可以很好地彌補糖蜜中只有碳源而沒有其他酵母生長所必需的營養物質，固將二者混合作為單細胞蛋白生產的發酵液。通過對酵母生長所必須的C/N可知酵母最適的C/N比為4/1，玉米黃漿水與糖蜜的混合液中添加少量氮源，其余養分足夠酵母正常的生長發酵［14］。

2.2 生長曲線的測定

測定酵母的生長曲線不但可以了解酵母的生長變化情況，而且還可以清楚地了解酵母的對數生長期、衰亡期以及它的一些生長特性，從而更好地生產單細胞蛋白飼料。另外，從酵母的生長曲線還可以得出酵母繁殖到最大量的時間，以及在隨后穩定期的生長中酵母細胞是否會產生自溶影響單細胞蛋白的生產。而干物質重量中粗蛋白的含量能更好地反映隨著發酵的進行，酵母菌體不斷增殖，發酵液的粗蛋白含量也隨之增加，為后續的研究打下好的基礎。2.2.1 產朊假絲酵母 圖1與圖2分別表示為產朊假絲酵母在搖瓶發酵過程中的干物質重量變化和粗蛋白含量變化情況。從圖中我們可以得出，在10～12h時，由于產朊假絲酵母的生長消耗了發酵液中的糖分等營養物質，因此發酵液的干物質重量呈下降趨勢。當發酵12～24h時，由于產朊假絲酵母到達了對數生長期，發酵液的干物質重量急劇上升，之后呈穩定趨勢。當在第48h時，發酵液的干物質重量達到最大為5.84g，與其對應的粗蛋白含量也達到了最大為1.29/100mL。在隨后的繼續發酵過程中，發酵液的干物質重量和粗蛋白含量持續下降。

經分析，由于當酵母接種于發酵液中，酵母有一個適應的階段，進入了微生物的延遲期;此后隨著酵母細胞的大量增殖，發酵液中的養分也不斷的被分解利用，酵母生長進入了對數生長期;隨著后續發酵的進行，發酵液中營養成分的不斷消耗，以及發酵液環境的改變，發酵液中的環境不再適合酵母的生長，酵母細胞開始自溶，發酵液干物質下降，粗蛋白含量也逐漸減少。

圖1 產朊假絲酵母的干物質重量隨時間變化的關系

圖2 產朊假絲酵母的粗蛋白含量隨時間變化的關系

2.2.2 白地霉 白地霉是一種酵母屬的霉菌，水解蛋白的能力強，環境適應能力好，非常適合發酵生產單細胞蛋白。它對蛋白質、多糖、油脂等生物質具有較強分解和轉化能力。了解白地霉的生長特性，對后續的研究有著非常必要的作用。圖3與圖4分別為白地霉在搖瓶發酵過程中的干物質重量變化與粗蛋白含量的變化情況。圖中所示，在0～12h內，由于白地霉的生長消耗了發酵液中的營養成分，因此發酵液的干物質重量呈下降趨勢。當發酵12～40h時，酵母的大量生長繁殖，發酵液的干物質重量也逐漸增大，與之對應的粗蛋白含量也不斷增大，到第40h，發酵液的干物質重量達到最大為5.61g，粗蛋白含量高達1.37g/100mL。之后的發酵過程中發酵液的干物質重量與粗蛋白含量呈下降趨勢。分析是由于發酵液中的營養物質被白地霉所消耗利用，并且酵母細胞生長所生成的次級代謝產物等改變了酵母細胞的生長環境，白地霉細胞自溶，干物質重量與粗蛋白含量下降。

圖3 白地霉的干物質重量隨時間變化的關系

2.2.3 熱帶假絲酵母 熱帶假絲酵母是降解轉化玉米粉和烴類有機物較強的一類酵母，可利用各種糖類滿足自身生長的需要，也是世界上生產SCP的主要菌種之一。圖5與圖6分別是熱帶假絲酵母在搖瓶發酵過程中干物質重量的變化與粗蛋白含量的變化情況。在0～28h發酵過程中，由于原料的大量分解、營養成分的消耗轉化，盡管有大量的熱帶假絲酵母生成，但仍然是分解轉化消耗的成分大于生成的成分，因此熱帶假絲酵母的干物質重量呈下降趨勢。在隨后的28～44h內，由于大量的酵母所需營養成分的存在，熱帶假絲酵母呈對數生長，在第44h，發酵液的干物質重量達到最大為5.78g，而其粗蛋白含量在第48h達到最大為1.25g/100mL。

圖4 白地霉的粗蛋白含量隨時間變化的關系

圖5 熱帶假絲酵母的干物質重量隨時間變化的關系

圖6 熱帶假絲酵母的粗蛋白含量隨時間變化的關系

經分析，當發酵到第44h，由于酵母細胞的繁殖生成量大于其消耗分解的營養物質，此時發酵液的干物質重量達到最大。隨后酵母細胞繼續增殖，逐漸消耗發酵液中的營養物質，到達第48h，酵母細胞分解利用的營養物質大于酵母細胞的生成量，發酵液的干物質重量呈下降趨勢，而此時發酵液中的粗蛋白含量達到最大。在后續的發酵過程中，由于酵母細胞的自溶，發酵液的干物質重量及粗蛋白含量均呈下降趨勢。

2.3 菌種的篩選

圖7和圖8分別是采用7種不同的酵母組合發酵所得到的干物質重量和粗蛋白含量。從圖7中可以看出白地霉與熱帶假絲酵母混合發酵時所得到的干物質重量最大為5.87g。如圖8所示，當白地霉與熱帶假絲酵母混合發酵時，所得的干物質中含粗蛋白最高為1.78g/100mL。

經分析，由于白地霉與熱帶假絲酵母互利共生，其生長優于各單菌種發酵。發酵液中的一些糖蜜等大分子物質不能完全被熱帶假絲酵母所利用，但由于白地霉的存在，可以水解消化發酵液中的一些大分子營養物質，使其更好地被自身以及熱帶假絲酵母所分解利用吸收，達到共生互利的作用，極大地促進了單細胞蛋白的生產。因此選擇白地霉與熱帶假絲酵母作為生產單細胞蛋白發酵的混合菌種。

圖7 菌種組合的發酵與干物質重量之間的關系

圖8 菌種組合的發酵與粗蛋白含量之間的關系

3 結論

玉米提取結晶糖后的黃漿水與糖蜜中含有大量的營養物質，其中糖蜜中所含總糖量高達49.38%，還原糖的含量為16.21%。黃漿水中也含有充足的礦物質元素，將其二者混合需添加少量的氮源，其余營養成分足夠酵母正常生長繁殖。實驗所選用的三種酵母均能夠利用黃漿水與糖蜜快速生長繁殖。其中，白地霉與熱帶假絲酵母(1∶1)在黃漿水∶糖蜜為1∶1的發酵液100mL，總接種量為10%，pH自然，30℃，180r/min混合發酵時，干物質重量達到最大為5.87g，粗蛋白含量為1.78g/100mL，均為所選用的七種菌種組合之首。因此，白地霉 (Geotrichum candidum)和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)為發酵黃漿水與糖蜜的最佳菌種組合。

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Growth characteristics of strains for single－cell－protein produced by yellow slurry water and molasses

LI Xiao－yu，MA Ying，WANG Lu
(School of Food and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China)

The crude protein，non－protein nitrogen，total sugar，reducing sugar，phosphorus，moisture，crude ash，lutein，elemental of the Yellow Slurry Water and molasses in the trash of the corn after extracting crystal sugar were analyzed.And then，selected Candida utilis，Geotrichum candidum and Candida tropicalis，three kinds of industrial yeast，as the strains fermented the mixture of yellow slurry water and molasses for single－cell－protein by shaking flask，the growth characteristics of three types of yeast was studied.And the best strain combination for production was screened.The results showed that the dry mass of the single－cell－protein can reach 5.87g，and the protein can reach 1.78g/100mL，when it was fermented by equivalent Geotrichum candidum and Candida tropicalis.

yellow slurry water;molasses;single－cell－protein;screening

TS201.3

A

1002－0306(2011)06－0216－04

2010－05－18

李小雨(1988－)，男，碩士研究生，研究方向:生物化工。