米醋沉淀中Bacillus subtilis DNA提取及RIC-RCR體系條件優(yōu)化

廖永紅，任文雅，孫寶國(guó)，徐 瑾，沈 晗，金志剛

(北京工商大學(xué)，化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京100037)

米醋沉淀中Bacillus subtilis DNA提取及RIC-RCR體系條件優(yōu)化

廖永紅，任文雅，孫寶國(guó)*，徐 瑾，沈 晗，金志剛

(北京工商大學(xué)，化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京100037)

利用稀釋平板法從米醋沉淀中分離獲得細(xì)菌，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，表明該細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。以該菌為實(shí)驗(yàn)材料，研究了細(xì)菌基因組DNA的提取方法，并將ERIC－PCR法首次應(yīng)用于醋液菌種，對(duì)此反應(yīng)體系的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終建立了適合于本實(shí)驗(yàn)室的ERIC－PCR體系。結(jié)果表明，采用改良的傳統(tǒng)細(xì)菌基因組DNA提取方法，所提取的DNA質(zhì)量較高，能夠滿(mǎn)足ERIC－PCR反應(yīng)的需要;建立的反應(yīng)體系為:25μL反應(yīng)體積10×擴(kuò)增緩沖液(含 Mg2+)2.5μL，20pmol/μL ERIC－PCR 引物 E1 1.0μL，20pmol/μL ERIC－PCR 引物 E2 1.0μL，DNA模板 2μL，2.5mmol/L dNTPs混合液 1.6μL，taq聚合酶 0.9μL，雙蒸水補(bǔ)齊;PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 變性4min，1 個(gè)循環(huán);94℃變性 30s，58℃退火 40s，72℃延伸 1min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸 4min。

細(xì)菌，分離，DNA 提取，ERIC－PCR，優(yōu)化

食醋在生產(chǎn)過(guò)程中需要添加大曲、麥曲、酶母菌及醋酸菌等，各種帶菌的原料和工具因操作問(wèn)題會(huì)帶來(lái)細(xì)菌的污染。雖然產(chǎn)品加熱滅菌時(shí)，一些不耐熱的微生物菌體殘留在食醋中造成混濁沉淀，一些耐熱的芽孢桿菌潛伏在醋中［1］，在適當(dāng)?shù)臏囟群蜖I(yíng)養(yǎng)條件下會(huì)緩慢生長(zhǎng)，影響著米醋的風(fēng)味及產(chǎn)品的質(zhì)量。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種嗜溫性的好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線(xiàn)和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子。且枯草芽孢桿菌具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單以及產(chǎn)生耐熱、抗逆芽孢等突出特征。ERIC－PCR(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，腸細(xì)菌基因間共有重復(fù)序列)技術(shù)是在隨機(jī)引物PCR(RAPD)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的［2－4］。ERIC－PCR 的原理［5－6］是:許多革蘭陰性桿菌中存在一段長(zhǎng)度為126bp，以多拷貝形式存在的反向重復(fù)序列。這段序列分布于基因組中，具有高度的保守性，在不同種間僅有拷貝數(shù)和位置變化。依據(jù)此重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，提取細(xì)菌基因組的總DNA，并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其保守、獨(dú)特的位置使這種PCR能產(chǎn)生多種獨(dú)特的擴(kuò)增產(chǎn)物(50～3000bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離形成DNA指紋圖譜(DNA遷移帶)，可根據(jù)這些電泳條帶來(lái)區(qū)分細(xì)菌的株(型)。在一定范圍內(nèi)，DNA遷移帶的大小和多少代表著此重復(fù)序列間的距離和重復(fù)次數(shù)。因此，基因組DNA的差異可清晰顯示在指紋圖譜上。這樣，對(duì)混合微生物群落結(jié)構(gòu)的分析就轉(zhuǎn)化為對(duì)其DNA指紋圖譜的分析。本實(shí)驗(yàn)以某企業(yè)提供的米醋為材料，進(jìn)行分離純化，獲得純菌株進(jìn)行基因組DNA提取方法的研究和ERIC－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米醋 企業(yè)提供的瓶裝米醋，肉眼觀(guān)察有明顯沉淀;培養(yǎng)基 土豆、麥芽汁、細(xì)菌、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基［7－8］。

T6型新世紀(jì)紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)，DK－S22型數(shù)顯恒溫水浴鍋，130s超凈工作臺(tái)，LRH－250型生化培養(yǎng)箱，Anymicro Dss顯微鏡，安萊Alphalmager Hp紫外凝膠成像系統(tǒng)，Dyc－33A型電泳槽，TC－XP－G型PCR熱循環(huán)儀。

1.2 細(xì)菌的分離與純化

無(wú)菌條件下，將米醋瓶蓋打開(kāi)，混合均勻后，定量采取實(shí)驗(yàn)醋樣，離心收集沉淀。用生理鹽水將沉淀打散，選取適宜的稀釋度后，以涂布平板法分別涂于土豆、麥芽汁、細(xì)菌和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)48h，檢查菌落出現(xiàn)情況。取單菌落，用接種針挖掘一小塊菌體移植于另一平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，再?gòu)拈L(zhǎng)有單菌落的平板中選取典型的細(xì)菌菌落，取菌體制成懸液，涂布培養(yǎng)、用革蘭氏染色法對(duì)細(xì)菌染色，在顯微鏡下觀(guān)察其形態(tài)、顏色，并照相，重復(fù)培養(yǎng)2～3次以分離純化菌種。將純化了的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)，待生長(zhǎng)完好后置于4℃冰箱中保存。

1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取

1.3.1 3種提取基因組DNA的方法比較 方法一:取單菌落接種于5mL相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在合適的溫度下培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)菌的生長(zhǎng)率不同，培養(yǎng)時(shí)間可由幾小時(shí)到幾天不等。

a.取1.0mL菌液置于1.5mL離心管中，13000r/min離心2min，棄上清。沉淀重懸于1.0mL 0.85%NaCl中，用槍頭吸打菌體使之混勻，散開(kāi)。室溫13000r/min離心2min，棄上清。沉淀重懸于550μL 1×TE中。

b.加8μL 蛋白酶 K(20mg/mL)，顛倒混勻，37℃溫育30min。加40μL 10%SDS，顛倒混勻，37℃溫育30min，應(yīng)為澄清的。加100μL 5mol/L NaCl充分混勻。加 80μLCTAB/NaCl溶 液，混 勻，65℃ 水浴10min。

c.加等體積(0.7～0.8mL)氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕振蕩混勻。室溫，14000r/min離心12min(可看到分三層)。將上清液轉(zhuǎn)移到一支新的1.5mL離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)輕輕振蕩混勻。14000r/min離心10min。

d.將上清液轉(zhuǎn)移到一支新的1.5mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕振蕩混勻。14000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移到一新的1.5mL離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，顛倒混勻后，－20℃靜置30min。室溫14000r/min離心8～10min。棄上清，加500μL70%乙醇，輕輕顛倒數(shù)次(洗鹽)。

e.室溫14000r/min離心3min。棄上清，倒置離心管，干燥 DNA沉淀10～15min。DNA沉淀溶于60μL ddH2O 中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法二:在方法一的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，即在步驟b和 c之間增加下述步驟，加入8μL 10mg/mL的Rnase，于37℃溫浴1h。其余步驟與方法一相同。

方法三:a.取1.0mL菌液于 1.5mL離心管中，13000r/min離心2min，棄上清。沉淀重懸于1.0mL 0.85%NaCl中，用槍頭吸打菌體使之混勻，散開(kāi)。室溫13000r/min離心 2min，棄上清。沉淀重懸于550μL 1×TE 中。b.加20μL溶菌酶(100mg/mL)，顛倒混勻，37℃溫育 30min。c.加 40μL 10%SDS和8μL 10mg/mL 的 Rnase，顛倒混勻，37℃ 溫浴 1h。d.細(xì)胞勻漿再用8μL蛋白酶K(20mg/mL)消化，37℃溫育30min。其余步驟與方法一相同。

1.3.2 DNA質(zhì)量檢測(cè) a.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):將所得DNA樣品進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，采用100V電壓，電泳1h，EB染色后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。b.DNA純度、濃度及提取率檢測(cè):取少量DNA樣品稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)在260、280nm處的吸光光度值。DNA純度的定性檢測(cè)，通過(guò)A260/A280的比值可以檢測(cè)所提DNA的純度。通常純DNA樣品 A260/A280≈1.8。若 A260/A280>1.9，可能有RNA污染;若A260/A280＜1.6，可能有蛋白質(zhì)污染。DNA濃度的計(jì)算:

濃度(μg·mL－1)=A260×50 ×稀釋倍數(shù)

注:1OD 值相當(dāng)于50μg·mL－1雙螺旋 DNA。

1.4 ERIC－PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

選取菌種的基因組DNA和ERIC－PCR的通用引物后進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，分別從對(duì)TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物、退火溫度、循環(huán)數(shù)幾個(gè)方面做單因素實(shí)驗(yàn)，找出各自適合的條件，而且每個(gè)合適的條件確定以后都被作為后續(xù)研究的一個(gè)條件。通過(guò)各個(gè)因子的組合對(duì)ERIC－PCR反應(yīng)體系的條件進(jìn)行篩選優(yōu)化。各個(gè)因素的梯度設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 影響ERIC－PCR反應(yīng)因素的優(yōu)化梯度設(shè)置

PCR結(jié)束后點(diǎn)樣于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，根據(jù)條帶的有無(wú)以及清晰程度和特異性來(lái)確定影響因素的最終濃度。ERIC－PCR的程序如下:94℃ 3min;94℃ 30s，58℃ 40s，72℃ 1min，30 個(gè)循環(huán);72℃4min;4℃保存。

1.5 16S rDNA分子鑒定

利用1.2的方法將分離得到的菌種進(jìn)行16S rDNA分子生物學(xué)鑒定。

a.利用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)3mL新鮮細(xì)菌菌液，提取細(xì)菌DNA。

b.細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增:利用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物27F和1492R引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列。引物信息:27F:5′－GTGCTGCAGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′

149 2R:5′－ CACGGATCCTACGGGTACCTTGTTACGACTT－3′

c.細(xì)菌16S rDNA序列測(cè)定:利用引物27F和1492R對(duì)細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序完成后，對(duì)其序列進(jìn)行拼接。

d.細(xì)菌16S rDNA序列比對(duì):登陸NCBI網(wǎng)站，利用Blast軟件對(duì)細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行序列比對(duì)，獲得其最相似細(xì)菌，確定樣品細(xì)菌的種屬信息，部分測(cè)序工作由北京基諾萊普生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離與純化

將滅菌后的醋液和未滅菌的醋液分別取0.1mL涂布于土豆、麥芽汁、細(xì)菌、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行好氧和厭氧培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌種在有氧條件下生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于無(wú)氧情況，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂和土豆培養(yǎng)基上分離到所要細(xì)菌，經(jīng)過(guò)反復(fù)純化后的菌種用于基因組DNA的提取。

2.2 菌種的形態(tài)特征

枯草桿菌是芽孢桿菌屬的一種。無(wú)莢膜，全身鞭毛，能活動(dòng)。橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色、在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭，需氧菌。菌種的顯微鏡照片見(jiàn)圖1。

圖1 100倍2#菌種顯微鏡圖

2.3 DNA提取方法的比較結(jié)果

基因組DNA的提取是進(jìn)行ERIC－PCR反應(yīng)的第一步，是進(jìn)行ERIC－PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)條件，所提取的基因組DNA的質(zhì)量直接關(guān)系著ERIC－PCR擴(kuò)增能否產(chǎn)生清晰和重復(fù)性較好的條帶。因此，在進(jìn)行PCR之前有必要對(duì)菌種DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)比較了3種細(xì)菌基因組提取方法。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。從DNA提取結(jié)果來(lái)看，方法一其A260/A280值為1.77。而方法二是在方法一的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，即多加了Rnase，去除了RNA的干擾，所提取的DNA的質(zhì)量較高，其A260/A280值為1.81，而且其濃度大小比較適中，能夠滿(mǎn)足ERIC－PCR的DNA模板的需要。

表2 不同提取方法的DNA濃度及吸光度比值

方法三為溶菌酶方法，溶菌酶可以作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，具有降解其肽聚糖的作用。從結(jié)果上可以看出，方法三A260/A280值為1.46，說(shuō)明有蛋白的存在，另外此方法所用的時(shí)間比較長(zhǎng)，而且實(shí)驗(yàn)成本也較高，從實(shí)際應(yīng)用的角度上來(lái)說(shuō)并不是最佳的DNA提取方法。所以，綜合考慮，方法二為少量提取細(xì)菌DNA的最佳方法。

采用方法二提取的基因組DNA經(jīng)過(guò)0.8%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌種總DNA的凝膠電泳圖譜

由圖2可以看出，此方法所提取的DNA質(zhì)量較好而且沒(méi)有RNA雜帶，同時(shí)也沒(méi)有蛋白質(zhì)和糖類(lèi)的污染。此基因組DNA可以用于接下來(lái)的ERIC－PCR實(shí)驗(yàn)。

2.4 ERIC－PCR反應(yīng)體系影響因素的優(yōu)化

ERIC－PCR技術(shù)的擴(kuò)增結(jié)果受到很多因素的影響。一般能影響PCR擴(kuò)增的因素均可影響到ERIC－PCR的擴(kuò)增結(jié)果。如Taq聚合酶、dNTPs、引物、退火溫度以及循環(huán)次數(shù)等。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)以上五個(gè)因素進(jìn)行了單因素優(yōu)化，建立起適合本實(shí)驗(yàn)室的ERIC－PCR體系。

2.4.1 Taq酶的優(yōu)化 Taq酶的活性與用量直接關(guān)系到PCR擴(kuò)增的成敗，是ERIC－PCR反應(yīng)體系的前提因素。酶量過(guò)多易發(fā)生非特異反應(yīng)，而且可能增加突變的機(jī)率，尤其在進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)盡量減少酶量，但酶量過(guò)少時(shí)反應(yīng)性能會(huì)下降。Taq酶的濃度如果太低，則合成的產(chǎn)物量減少;如果濃度過(guò)高，可能引起非特異性擴(kuò)增。Taq酶選擇的量為0.3、0.5、0.7、0.9、1.1μL，其擴(kuò)增結(jié)果電泳如圖 3 所示，由圖 3可以看出，Taq酶的量為0.9μL時(shí)沒(méi)有非特異性條帶，特征條帶在1000bp以下。

2.4.2 三磷酸脫氧核苷酸的影響 dNTP濃度的變化對(duì)于ERIC－PCR條帶的數(shù)量和強(qiáng)弱影響明顯，當(dāng)dNTP濃度不足時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物減少;而當(dāng)dNTP濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)使擴(kuò)增錯(cuò)誤配對(duì)的幾率大大增加，過(guò)高的dNTP可與Mg2+結(jié)合，使得反應(yīng)體系中Mg2+總量下降，Taq活性受到影響。dNTPs加入量為1.6、1.8、2.0、2.2、2.4μL，其擴(kuò)增電泳如圖 3 所示，可以看出dNTP的量為1.6μL時(shí)比較好。2.4.3 引物添加量對(duì)ERIC－PCR的影響 引物濃度主要影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，引物濃度變化實(shí)質(zhì)上是改變引物與模板之間的配比幾率，從而影響擴(kuò)增效率。引物濃度如果偏低，就會(huì)受到競(jìng)爭(zhēng)的抑制，引物和模板結(jié)合的幾率下降，有可能擴(kuò)增不出來(lái)，或者造成條帶過(guò)淺、缺失等現(xiàn)象。引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)誤和非特異性產(chǎn)物增加，同時(shí)增加引物之間形成二聚體的幾率，也可能造成擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失。

本實(shí)驗(yàn)采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，梯度設(shè)置如下:0.6、1、1.4、1.8、2.2μL，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖 3 所示，由圖3可以看出引物的量為1μL時(shí)比較好。

圖3 ERIC－PCR條件優(yōu)化電泳圖

2.4.4 退火溫度對(duì)ERIC－PCR的影響 退火溫度是影響PCR反應(yīng)的重要因素之一，決定著PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性，溫度高特異性強(qiáng)，但溫度過(guò)高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降;溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加，合適的退火溫度一般在45～68℃之間。實(shí)驗(yàn)設(shè)置的溫度梯度為:55、56.2、58.0、60.6、63℃，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖可以看出，退火溫度升高，會(huì)減少雜帶的產(chǎn)生，但是過(guò)高的溫度又會(huì)造成條帶的缺失，所以經(jīng)過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)后得出最佳退火溫度為58℃。

圖4 ERIC－PCR退火溫度優(yōu)化電泳圖

2.4.5 循環(huán)次數(shù)對(duì)ERIC－PCR的影響 循環(huán)次數(shù)的設(shè)定可根據(jù)模板DNA的量、擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè)定30～40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配幾率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的循環(huán)次數(shù)為20、25、30個(gè)循環(huán)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定30個(gè)循環(huán)為最佳循環(huán)數(shù)。

2.5 ERIC－PCR反應(yīng)體系的建立

經(jīng)過(guò)對(duì)影響ERIC－PCR反應(yīng)的各個(gè)因素的優(yōu)化，建立了適合于本實(shí)驗(yàn)室的 PCR反應(yīng)體系:在25μL的反應(yīng)體積中 ERIC－PCR反應(yīng)體系成分為:25μL反應(yīng)體積 10×擴(kuò)增緩沖液(含 Mg2+)2.5μL，20pmol/μL ERIC－PCR 引物 E1 1.0μL，20pmol/μL ERIC－PCR 引物 E2 1.0μL，DNA 模板 2μL，2.5mmol/L dNTPs混合液 1.6μL，taq聚合酶 0.9μL，雙蒸水補(bǔ)齊;ERIC－PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃變性4min，1個(gè)循環(huán);94℃變性 30s，58℃退火 40s，72℃延伸 1min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸4min。

2.6 16S rDNA分子鑒定結(jié)果

登陸 NCBI網(wǎng)站，利用 Blast軟件對(duì)細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行序列比對(duì)，獲得其最相似細(xì)菌，確定樣品細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。NCBI登錄號(hào)為AL009126，相似度為96%。

3 討論

基因組DNA的質(zhì)量對(duì)ERIC－PCR反應(yīng)有著重要的影響，它決定了PCR的成功與否。而提取的DNA的方法因?qū)嶒?yàn)材料的不同也有所區(qū)別，本實(shí)驗(yàn)比較了3種提取DNA的方法，基本上是傳統(tǒng)方法和溶菌酶方法的比較，溶菌酶的方法提取的DNA的總量很高但是純度不高。方法二是在傳統(tǒng)方法上進(jìn)行了改進(jìn)，在中間的過(guò)程中加入了Rnase降解步驟，基本上解決了RNA污染的問(wèn)題，是提取蠟狀芽孢桿菌的最適合方法。方法三加入了Rnase和溶菌酶，但是由于成本比較高和時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)而受到限制。

ERIC－PCR技術(shù)具有DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低、操作技術(shù)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。但由于其使用的是通用引物，所以合適的PCR條件是決定成功與否的關(guān)鍵性因素。擴(kuò)增條件的變化會(huì)對(duì)ERIC－PCR圖譜產(chǎn)生很大的影響，從而影響ERIC－PCR分析的準(zhǔn)確性。而條帶的準(zhǔn)確性是進(jìn)行PCR分析的重要前提條件。在PCR反應(yīng)中由于反應(yīng)體系不適宜則會(huì)出現(xiàn)兩種極端的現(xiàn)象，一種是非特異性擴(kuò)增嚴(yán)重，產(chǎn)生許多不確定的產(chǎn)物甚至無(wú)目的條帶，另一種是擴(kuò)增不到任何產(chǎn)物。這時(shí)需要通過(guò)改變Taq酶的用量、dNTP濃度、引物用量、Mg2+濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等加以?xún)?yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用了單因素遞進(jìn)篩選法，以上一輪篩選出的值用于下一個(gè)因素的篩選，層層遞進(jìn)的方式，經(jīng)過(guò)比較和分析，建立穩(wěn)定且適合該菌種的ERIC－PCR體系為:25μL反應(yīng)體積10×擴(kuò)增緩沖液(含 Mg2+)2.5μL，20pmol/μL ERIC－PCR 引物E1 1.0μL，20pmol/μL ERIC－ PCR 引物 E2 1.0μL，DNA 模板 2μL，2.5mmol/L dNTPs混合液 1.6μL，taq聚合酶0.9μL，雙蒸水補(bǔ)齊;ERIC－PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃變性 4min，1 個(gè)循環(huán);94℃ 變性 30s，58℃ 退火40s，72℃延伸 1min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸4min。

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Genomic DNA extraction from Bacillus subtilis in vinegar precipitation and the optimization of the system of ERIC－PCR

LIAO Yong－h(huán)ong，REN Wen－ya，SUN Bao－guo*，XU Jin，SHEN Han，JIN Zhi－gang
(College of Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100037，China)

Bacillus subtilis were isolated by streak platemethod.It was identified that was Bacillus subtilis by using the 16S rDNA gene.Bacillus strains were used as experimental materials.The method of genomic DNA extraction was studied in Bacillus and the conditions of ERIC－PCR.Finally，ERIC－PCR reaction system was suitable for our lab was established.The results showed that high－grade genomic DNA which could meet the requirements of PCR reaction was obtained by the modified methods.The established ERIC－PCR reaction system was as follows:10×Buffer(Mg2+)2.5μL，20pmol/μL primer E1 1μL，20pmol/μL primer E2 1μL，DNA template 2μL，2.5mmol/L dNTPs 1.6μL，Taq polymerase 0.9μL，ddH2O 16μL，25μL reaction volume.The reaction program of PCR was devised as follows:4min degeneration at 94℃(one cycle)，then 30s degeneration at 94℃，40s annealing at 58℃，and 1min extension at 72℃(30 cycles)，and then 4min final extension at 72℃.

bacillus;isolation;DNA extraction;enterobacterial repetitive intergenic consensus－PCR(ERICPCR);optimization

TS201.3

A

1002－0306(2011)06－0212－05

2010－05－06 *通訊聯(lián)系人

廖永紅(1965－)，女，副教授，主要從事有關(guān)食品發(fā)酵工程方面的教學(xué)和科研工作。

國(guó)家“十一五”科技支撐項(xiàng)目。