玉米干磨酒精生產期間原料內嘔吐毒素和赤霉烯酮的去向

余元善，邱禮平，吳 暉，* ，唐語謙

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510641;2.廣東食品藥品職業學院，廣東廣州510520)

玉米干磨酒精生產期間原料內嘔吐毒素和赤霉烯酮的去向

余元善1，邱禮平2，吳 暉1，*，唐語謙1

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510641;2.廣東食品藥品職業學院，廣東廣州510520)

測試了幾株工業上常用的酒精酵母在酒精發酵過程中轉化赤霉烯酮(ZEN)和嘔吐毒素(DON)的能力。結果表明:所測試的五株酒精酵母都具有轉化ZEN成赤霉烯醇(ZOL)的能力，轉化產物中兩種構型的ZOL都有，兩種構型的比例因不同的菌株而有明顯的差異，但所有的五株酵母都不具有轉化DON的能力。同時，使用人為添加有1μg/mL ZEN和1μg/mL DON的優質玉米為原料，以安琪牌超級酒精酵母為發酵菌種，模擬玉米干磨酒精生產工藝，在發酵結束后，發酵醪被分成三部分，即酒精、酒糟離心液和濕酒糟。HPLC分析結果表明:酒精中基本檢測不到兩種真菌毒素及其代謝物，ZEN及其代謝物主要分布在濕酒糟，而DON主要分布在酒糟離心液中。另外，從兩種真菌毒素及其代謝物總的含量看，在整個工藝生產過程中，兩種真菌毒素及其代謝物基本上沒有發生降解。

玉米酒精生產，嘔吐毒素，赤霉烯酮，轉化

隨著國家對燃料酒精需求的增加，我國每年都有大量玉米被用于生產燃料酒精。目前，玉米酒精的生產主要有兩種生產工藝—干磨和濕磨。濕磨工藝首先將玉米分離成淀粉、麩皮、胚芽等，雖然它能夠提高玉米利用率，但相比干磨法來說，需要更大的成本投資，所以國內外大部分玉米酒精廠都采用干磨工藝。在干磨玉米酒精生產工藝中，粉碎后的玉米粒與水混合調成一定濃度的漿液，漿液經糖化處理后，添加一定比例的酒精酵母進行厭氧發酵。發酵后的成熟醪經精餾后生成一定濃度的酒精，非揮發性的蒸餾殘渣經離心后生成濕糟和酒糟離心液兩部分。酒糟離心液蒸發濃縮后與濕糟混合，干燥制成的產品常稱為dried distillers’grains and solubles(DDGS)。DDGS中含有較高的蛋白質、多種維生素等成分，一般作為動物飼料添加劑出售［1－2］。但是DDGS在作為動物飼料添加劑時，殘留在DDGS中的真菌毒素對動物的健康構成了嚴重的威脅［3］。真菌毒素是農作物被真菌污染產生的一類有毒性或致癌性的次級代謝產物。玉米在生長、收獲和儲藏期間很容易被各種真菌污染，污染后的玉米粒上常含有不同濃度的各種真菌毒素。在玉米粒中，主要檢測出的有伏馬菌素(Fumonisin)、黃曲霉毒素(aflatoxin，AFN)、嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)等真菌毒素［4］。在玉米粒中，玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素兩種毒素的含量比較高，對動物的危害最突出，并且豬對它們也特別敏感。玉米赤霉烯酮及其衍生物都能對家禽(或畜)的生殖系統造成形態或功能上的變化，特別是雌性動物［5］。DON能夠抑制動物體內蛋白質和核酸的合成，造成動物食欲減退，生長緩慢。高劑量能引起動物發生嚴重的嘔吐反應［6］。本研究的目的是調查幾株工業上常用的酒精酵母是否具有轉化赤霉烯酮和嘔吐毒素的能力，并且確定玉米干磨酒精生產期間原料內嘔吐毒素和赤霉烯酮的去向，從而為綜合開發玉米酒精糟(DDGS)提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae) 來源見表1，所有的菌株都培養在麥芽汁瓊脂斜面上，4℃低溫保藏，并定期接種轉代;DON和ZEN 自己從禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)的小麥培養物中萃取和純化;α－ZOL和β－ZOL的標準品 Sigma公司;各種真菌毒素的標準儲備液 用70%甲醇水溶液溶解并稀釋到所需濃度;甲醇 色譜級;超純水 美國Milli－Q Academic Water system制備;優質玉米粒 從郊區農村收購;耐高溫α－淀粉酶和糖化酶 當地酶試劑公司;微生物培養基 廣州環凱微生物試劑有限公司;其它試劑 均為國產分析級。

表1 酵母菌株種類

氮吹儀 Organomation Associates，Inc;PuriToxSR TC－M160真菌毒素多功能凈化柱 Trilogy Analytical Laboratory;Waters公司高效液相色譜檢測系統 配置有 Waters 700 controller，Waters 2996 photodiode array detector和Waters 717 plus autosampler;實驗室小型玻璃精餾裝置，錘式粉碎機，高壓蒸汽滅菌鍋，低速離心機，恒溫水浴鍋，恒溫氣浴搖床，顯微鏡，旋轉蒸發儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米糖化醪的制備［1，8］將從郊區收購的優質玉米粒用75%酒精浸泡5min后，自來水漂洗，55℃烘干，以除去玉米粒表面殘留的大部分真菌毒素。烘干后的玉米粒用粉碎機粉碎至顆粒大小平均1mm左右。300g粉碎后的玉米粉與1000g水混合成玉米粉漿，并調節玉米粉漿的pH至6.0。接著，在121℃高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮15min，待其冷卻到80～90℃后，按3U/g干淀粉的比例添加耐高溫α－淀粉酶，為了使玉米淀粉充分液化成糊精，90℃保持30min。液化后的玉米粉漿冷卻到60℃左右后，調節其pH到4.5，加入1.0g糖化酶(5萬U/g酶粉)，糖化3.5h后即成玉米糖化醪。待玉米糖化醪冷卻到30℃左右時，就可用于酵母酒精發酵。

1.2.2 酒精酵母種子液的制備 向250mL搖瓶中添加50mL麥芽汁培養液體，6層紗布封口，115℃高壓蒸汽滅菌15min。然后，分別從各株酒精酵母麥芽汁瓊脂斜面上挑取一環菌體接入250mL搖瓶中，將搖瓶放入恒溫氣浴搖床中，28℃，200r/min培養，培養30h后作為種子液使用。

1.2.3 酒精酵母對ZEN和DON轉化能力實驗 在無菌操作條件下，分別向若干個15mL的螺蓋塑料管中添加10mL新鮮制備的玉米糖化醪，根據實驗要求，向各管中添加不同量的ZEN標準儲備液，混合后靜置1h。然后，向各管中添加一定量的酒精酵母種子液，使發酵前的酵母數量達到1×107個/mL，28℃靜置培養。酵母細胞數量的計數采用顯微鏡血球板計數法。

按實驗要求，定期取出每個濃度組的發酵醪，4000r/min離心5min，將上清液轉入另一塑料管中。接著，向沉淀殘渣中加入10mL甲醇，旋渦混合5min，4000r/min離心5min，將上清液也轉入同一塑料管中。混合兩次離心上清液，取其中部分液體過真菌毒素凈化柱，濾過液用HPLC檢測。對于較低濃度組，為了提高檢測的準確度，離心上清液用旋轉蒸發儀在50℃下蒸發干，加入15mL三氯甲烷在水槽式超聲波儀中溶解蒸發殘渣。將溶解有蒸發殘渣的三氯甲烷相轉入另一塑料管中，用氮吹儀在50℃蒸發干，用3mL 50%甲醇水溶液溶解，并通過真菌毒素凈化柱凈化，濾過液用HPLC檢測。DON的轉化實驗也采用同樣的方法。

1.2.4 玉米干磨酒精生產中各部分產品內嘔吐毒素和赤霉烯酮及其代謝物含量分布研究 將500mL新鮮制備的玉米糖化醪(分別含有1μg/mL的ZEN和DON)在無菌條件下加到1L的三角瓶中，同時接入適量的Y1酵母種子液(初始酵母細胞濃度達到1×107個/mL)，30℃靜止培養。培養60h后，發酵結束。發酵結束后，發酵成熟醪采用實驗室小型玻璃精餾柱精餾分離出酒精，非揮發性的蒸餾殘留物即酒精糟用低速離心機4000r/min，離心5min。合并所有的離心上清液即為酒糟離心液，固體沉淀即為濕酒糟。

酒精部分用0.22μm的濾膜過濾后直接用HPLC檢測其中嘔吐毒素和赤霉烯酮及其代謝物的含量。取20mL酒糟離心液，用20mL正己烷萃取2次，棄去正己烷層。被正己烷萃取后的酒糟離心液采用1.2.3中的方法濃縮、凈化。為了測定濕酒糟中兩種毒素及其代謝物的含量，稱取20g濕酒糟到一塑料管中，用40mL甲醇提取兩次，每次旋渦混合5min，4000r/min離心5min。將兩次離心上清液合并，合并后的離心液體也采用1.2.3中的方法濃縮、凈化。凈化后的濾液直接用HPLC檢測。

1.2.5 液相色譜分析檢測條件［9］在實驗中，根據ZEN及其代謝物和DON及其代謝物的極性和紫外吸收的差異，采用不同的色譜條件分別檢測。ZEN和其代謝物的分離檢測采用Waters XTerraRMS C18分離柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為60%甲醇水溶液，流速1.0min/mL，柱溫40℃，紫外檢測器檢測波長274nm;DON和其代謝物的分離檢測采用Waters XTerraRMS C18分離柱(4.6mm ×150mm，5μm)，流動相為20%甲醇水溶液，流速0.8min/mL，柱溫40℃，紫外檢測器檢測波長220nm。為了增加分離柱的使用時間，在其前面安裝有Waters XTerraRC18保護柱(5μm)。

1.2.6 數據分析和統計 實驗中每個不同的處理重復三次，結果取三次的平均值。

2 結果與討論

2.1 酒精酵母對ZEN轉化的研究

在10mL玉米糖化醪(添加有5μg/mL ZEN)中接種各種酵母發酵后，比較不同發酵時期的發酵醪中ZEN的色譜分離圖，可以發現兩個新的物質峰生成，通過比較兩個新物質峰的紫外吸收圖譜和添加ZOL標準品進行色譜分離等方式，可以確定兩個新物質峰分別是α－ZOL和β－ZOL。圖1顯示了Y1酵母不同發酵時期的發酵醪中ZEN的色譜分離圖的變化。

圖1 Y1酵母不同發酵時期發酵醪中ZEN的色譜分離圖的變化

在實驗中所研究的5株菌株都具有轉化ZEN成ZOL的能力，轉化產物中兩種構型的ZOL都有，兩種構型的比例因不同的菌株而有明顯的差異。表2列出了五株酵母菌株分別在10mL添加有5μg/mL ZEN的玉米粉糖化醪中發酵72h后ZEN及其代謝物的高效液相色譜檢測結果。

表2 10mL的玉米粉糖化醪中(含有5μg/mL ZEN)被五株酵母分別發酵72h后ZEN及其代謝物的含量(μg)

在研究中，我們向玉米粉糖化醪中添加了不同濃度的 ZEN(0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0μg/mL)，用 5株酵母分別發酵72h后，比較了發酵醪中ZEN及其代謝物的含量。發現隨著玉米糖化醪中ZEN濃度的增加，各株酵母對ZEN的轉化率(發酵后ZEN的含量與發酵前ZEN含量的比值)明顯下降，0.5μg/mL濃度組中，各株酵母對ZEN的轉化率普遍在75%～80%之間，而15μg/mL各株酵母對ZEN的轉化率普遍下降到65%左右，但產物中ZOL兩種構型的比例基本保持不變。可以推斷，幾株酒精酵母對ZEN的轉化速率可能受到產物ZOL濃度的抑制。

2.2 酒精酵母對DON轉化的研究

在20mL玉米糖化醪(添加有10μg/mL ZEN)中接種各種酵母發酵后，比較不同發酵時期的發酵醪中嘔吐毒素的色譜分離圖，發現各個不同時期的發酵醪中嘔吐毒素含量基本一致，所研究的五株酵母對DON均無轉化能力。圖2顯示了Y1酵母不同發酵時期發酵醪中嘔吐毒素的色譜分離圖的變化。

圖2 Y1酵母不同發酵時期發酵醪中嘔吐毒素的色譜分離圖的變化

2.3 嘔吐毒素和赤霉烯酮及其代謝物在玉米干磨酒精生產后各產品中含量分布研究

500 mL(分別含有1μg/mL的ZEN和DON)玉米糖化醪經Y1酵母(安琪牌超級酒精酵母)發酵72h后，發酵成熟醪經過精餾后，產生了酒精、酒糟離心液和濕酒糟三部分，我們分別檢測了各個部分中DON和ZEN及其代謝物的含量，結果見表3。

表3 在玉米酒精發酵成熟醪各部分分離物中兩種真菌毒素及其代謝物的含量

從表3可知，酒精中檢測不出兩種毒素及其代謝物;DON在酒糟離心液體和濕酒糟中的濃度差異不明顯，濕酒糟對DON沒有很強的吸附作用，90%以上的DON分布在酒糟離心液中;ZEN及其代謝物在濕酒糟中的含量是酒糟離心液中的30倍以上，濕酒糟對ZEN及其代謝物具有很強的吸附力，ZEN及其代謝物(85%～88%左右)主要富集在酒精糟中，這可能與酵母細胞壁成分有關。很多研究報道酵母細胞壁多糖成分對ZEN具有很強的吸附力［10］。

在整個玉米酒精生產過程中，除了ZEN發生轉化外，兩種真菌毒素在總的含量上變化很小，在整個工藝生產過程中，兩種真菌毒素及其代謝物基本上沒有發生降解。

3 結論

在玉米糖化醪的酒精發酵中，我們研究的五株酒精酵母都能把ZEN轉化為ZOL，并且都具有很高的轉化率。轉化產物中β－ZOL的雌激素活性跟ZEN差不多，特別是α－ZOL的雌激素活性比ZEN高3～4倍，這就要求我們國家的質檢部門在檢測酒精糟等酵母轉化副產物中ZEN的含量時要特別重視ZOL含量的測定。

ZEN和DON兩種毒素及其代謝物在濕酒糟和酒糟離心液中分布不均勻，我們在對濕酒糟和酒糟離心液綜合利用時，可以考慮將兩者分開單獨處理。

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Fate of deoxynivalenol and zearalenone during dry grind corn ethanol production

YU Yuan－shan1，QIU Li－ping2，WU Hui1，*，TANG Yu－qian1
(1.College of Light Industry ＆ Food，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China;2.Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China)

The transformation of zearalenone and deoxynivalenol by five alcohol yeasts and its fate during dry grind corn ethanol production were researched.All five alcohol yeasts can transform zearalenone into zearalenol，the ratio of α－zearalenol and β－zearalenol produced by five alcohol yeasts was different，but all five alcohol yeasts didn’t have the ability to transform deoxynivalenol.After corn saccharified mash added 1μg/mL ZEN and 1μg/mL DON was fermented by Angel brand super alcohol yeast，was separated into three fractions，including ethanol fraction，thin stillage and wet stillage.No mycotoxins and its metabolites could be detected in the ethanol fraction.Wet stillage have strong adsorption to ZEN and its metabolites，but weak adsorption to deoxynivalenol，so that the great proportion of ZEN and its metabolites concentrates in wet stillage，and deoxynivalenol mostly distributes in thin stillage.In addition，according with the total contents of two mycotoxins and its metabolites，they almost did not degraded during dry grind corn ethanol production.

corn ethanol production;deoxynivalenol;zearalenone;transformation

TS201.1

A

1002－0306(2011)06－0208－04

2010－06－12 *通訊聯系人

余元善(1983－)，男，博士生，研究方向:食品質量與安全。

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2009CB118601)。