LC FT-ICR MS 精確分析卵清蛋白在真空干燥過程中的煻期貨修飾

涂宗財，王 輝，劉成梅，劉光憲，肖 輝

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047;2.江西省農業科學院食品加工研究開發中心，江西南昌330200;3.美國葉史瓦大學愛因斯坦醫學院，美國紐約10461)

LC FT-ICR MS 精確分析卵清蛋白在真空干燥過程中的煻期貨修飾

涂宗財1，王 輝1，劉成梅1，劉光憲2，肖 輝3

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047;2.江西省農業科學院食品加工研究開發中心，江西南昌330200;3.美國葉史瓦大學愛因斯坦醫學院，美國紐約10461)

研究了卵清蛋白與葡萄糖混合物在真空干燥的過程中，卵清蛋白的糖基化修飾情況。首次采用胃蛋白酶和液相－傅立葉變換離子回旋共振(LC－FT－ICR)精確質譜分析技術對卵清蛋白的糖基化修飾位點進行研究，其蛋白質覆蓋率可以達到100%，研究發現在真空干燥過程中，卵清蛋白中的賴氨酸會與還原糖發生美拉德初級反應，形成糖基化修飾，主要發生在卵清蛋白的K47，56，62，182，190，323和370的賴氨酸氨基上，而卵清蛋白中的精氨酸和氮末端氨基未發現被糖基化修飾;同時，采用離子碰撞誘導解離三級質譜CID－MS3驗證m/z7863+的離子峰為m/z7323+的離子峰上添加一個162Da。本論文的研究為精確分析蛋白質修飾的一級結構變化提供了重要的研究方法，為真空干燥在實驗分析中的應用提供重要參考。

真空干燥，糖基化，卵清蛋白，液相－傅立葉變換離子回旋共振質譜(LC FT－ICR MS);胃蛋白酶

美拉德反應是食品加工、貯藏中普遍存在的且重要的化學反應，該反應的初級階段是蛋白質中的賴氨酸或精氨酸的ε－氨基和氮末端氨基與還原糖之間形成Schiff產物，然后發生重排生成Amadori或者Heyns產物［1］。美拉德反應的初級階段是氨基與還原糖反應［2］，實現蛋白質的糖基化修飾。目前研究發現，蛋白質在加熱、貯藏及人體生理活動過程中均會發生美拉德反應，在營養方面會導致蛋白質的必需氨基酸損失［3－4］，在病理研究方面是某些疾病的重要表征，同時也有研究表明美拉德產物具有很好的抗氧化活性和抗過敏性［5］。由此可見，在相關分析實驗過程中，樣品前處理對蛋白質美拉德反應的影響非常重要。目前在生物、食品及分析檢測領域，真空干燥以其快速、簡便、溫和等優點而被廣泛應用。但是，樣品在真空干燥過程中，蛋白質是否會和還原糖發生美拉德反應，導致蛋白質的重要氨基酸被糖基化修飾，而對實驗結果造成影響，目前，國內外未見相關研究報道。因此，本工作擬采用測序級胃蛋白酶和 LC FT－ICR精確質譜技術分析卵清蛋白(Ovalbumin，Oval.)和葡萄糖混合物在真空干燥過程中的糖基化修飾情況，并采用CID－MS3對糖基化修飾離子峰進行驗證。

表1 天然Oval.的胃蛋白酶酶解肽中含有賴氨酸的肽段分布

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵清蛋白Ⅳ、D－葡萄糖、胃蛋白酶 Sigma公司;其他化學試劑 sigma，分析純試劑。

FT－ICR MS 美國Varian公司;LTQ－ESI CID MS 美國應用生物系統公司;配兩個LC－10AD泵的液相 日本島津公司;1.0mm×50mm C3柱子 美國Micro－Tech Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵清蛋白與葡萄糖混合物的真空干燥處理

采用pH7.8Tris HCl溶液配制20mg/mL卵清蛋白、10mg/mL葡萄糖混合溶液 100μL，在真空度為－0.1MPa，20℃條件下，旋轉真空干燥8h，得到卵清蛋白與葡萄糖固體混合物樣品(水分含量2.34% ±0.2%)。

移取200μL的超純水添加于干燥后的樣品管中，使固體樣品完全溶解，采用5000分子量濾膜除去多余葡萄糖，純化后卵清蛋白定容至200μL，備用。1.2.2 巰基還原及乙?；幚?添加 10μL 200mmol/L DTT溶液于樣品中，混勻，室溫條件下放置1h;添加50μL 200mmol/L碘乙酰胺溶液于樣品溶液中，混勻，室溫條件下放置1h;添加50μL 200mmol/L DTT溶液于樣品溶液中，混勻，室溫條件下放置1h。而后添加690μL超純水至樣品溶液中，備用。

1.2.3 胃蛋白酶酶解 移取0.5μL還原乙?；蟮穆亚宓鞍讟悠啡芤河?0μL pH2.2的鹽酸溶液中，添加5μL 1%的胃蛋白酶溶液，在0℃條件下酶解10min，移取20μL酶解液上樣。

1.2.4 LC FT－ICR MS檢測分析［6］采用雙泵微米級液相進行梯度洗脫，流動相A:5%乙腈，0.1%甲酸水溶液;流動相 B:95%乙腈溶液。洗脫梯度為:0～5min，98%A，2%B;6min，85%A，15%B;15min，70%A，30%B;16min，50%A，50%B;17～22min，5%A，95%B;23min，95%A，5%B;28min，STOP。流速為0.05mL/min，進樣量為20μL，液相設備與FT－ICR直接連接，在6min時采集圖譜，采集時間為15min。

1.2.5 LTQ－CID MS3檢測分析 分別收集步驟1.2.4中LC的洗脫液，采用LTQ－CID MS3進行檢測。借助哥倫比亞大學的蛋白質分析工具網站進行分析。

2 結果與討論

2.1 天然Oval.的胃蛋白酶酶解肽圖譜

對蛋白質的糖基化位點進行定位的研究一般采用測序級胰蛋白酶［7－8］、Asp N［9］等特異性強的蛋白質酶進行酶解，但是由于胰蛋白酶的特異性位點為賴氨酸和精氨酸，而蛋白質的糖基化位點一般為賴氨酸和精氨酸，因此胰蛋白酶在進行蛋白質的糖基化位點定位研究時存在一定困難，而Asp N的酶活相對較差，檢測比較困難，蛋白質的覆蓋率較低。因此，本論文首次采用特異性較差的胃蛋白酶對蛋白質進行短時間酶解，對酶解肽進行質譜分析。

FT－ICR MS為高精確質譜技術，其精確度可以達到1ppm，本論文采用該質譜技術對胃蛋白酶酶解肽進行檢測，通過軟件分析和哥倫比亞大學的蛋白質分析工具網站精確確定酶解液中的主要肽段，蛋白質覆蓋率可以達到100%。

表1為測序級胃蛋白酶酶解卵清蛋白后的肽段分布，其中離子峰為m/z750，m/z732+3，m/z888+2的肽段有少量被糖基化，即發現糖基化肽段的離子峰(+162Da)，因此，天然Oval.中的K17和K93被糖基化修飾。由于m/z732+3的蛋白質片段中含有兩個K，結合m/z783+2中僅含有K47且未出現糖基化修飾的離子峰，因此，可以斷定K56被糖基化修飾。

表2 卵清蛋白酶解肽段中新的糖基化離子峰

蛋白質中的R和氮末端氨基也會與還原糖發生美拉德反應，但是，通過對相關肽段的分析，未發現天然Oval.中的R和氮末端氨基發生糖基化修飾的離子峰。

2.2 LC FT－ICR對真空干燥后Oval.進行測量

蛋白質與還原糖一般在加熱、長期貯藏或人體生理活動中容易發生Maillard反應，從而導致蛋白質中賴氨酸、精氨酸的破壞和營養損失。因此，真空干燥過程中，可能會導致蛋白質的氨基酸損失或糖基化修飾，從而影響實驗分析的結果。本論文針對真空干燥對卵清蛋白的糖基化修飾情況進行分析，研究發現，真空干燥過程中，蛋白質會發生一定的糖基化修飾作用。

由表2中可看出，離子峰為589+2、595+2、971+2、653+2、665+2的肽段均出現了+162Da的新峰，分別為670+2、676+2、1052+2、734+2、746+2，而 m/z732+3的肽段+162Da為m/z786+3，在天然Oval.中即存在，但是，經過真空干燥處理后，出現新的離子峰m/z840+3，糖基化肽的離子峰強度明顯比天然蛋白質的離子峰高，如圖1。

圖1 天然Oval.(A)和處理后Oval.(B)酶解肽段

由于 R和氮末端氨基也可以與還原糖發生Maillard反應［10］，因此，本研究比較分析了真空干燥前后的Oval.胃酶解肽中含有R的肽段和含有氮末端的肽段m/z824，未發現有糖基化修飾的新的離子峰出現，因此，可以斷定，在真空干燥過程中，可能會導致蛋白質賴氨酸的損失。

2.3 CID MS3對母離子峰進行質譜分析

通過計算可以得出，增加162Da的新的離子峰即為發生糖基化修飾。為了對此進行驗證，本論文采用CID MS3進行分析。如圖1，以m/z7323+為例，糖基化后的新的離子峰為7863+，由于糖基化肽段進行MS2分析時，糖基被打散，無法準確分析肽段的氨基酸序列，因此，對m/z786+3的裂解峰m/z7323+進行CID MS分析，如圖2。

m/z786+3的裂解峰 732+3的 CID MS圖譜與m/z732+3［VYLGAKDSTRTQINKVVRF］的裂解質譜圖正好吻合，如等主要峰均相符。因此，可以準確判定，m/z786+3是肽段VYLGAKDSTRTQINKVVRF(m/z732+3)的糖基化修飾離子峰。

圖2 m/z7863+裂解峰m/z7323+的CID MS質譜圖

3 結論

綜上分析，在真空干燥過程中，卵清蛋白中的賴氨酸會與還原糖發生美拉德初級反應，賴氨酸上發生糖基化修飾，而卵清蛋白中的R和氮末端氨基不會與還原糖發生美拉德反應。本論文采用胃蛋白酶酶解和LC FT－ICR精確質譜技術可以準確分析蛋白質的糖基化修飾情況，其蛋白質覆蓋率可以達到100%，與胰蛋白酶、AspN等測序級蛋白酶相比，胃蛋白酶的酶解時間較短，可以在0℃條件下進行，從而大大降低酶解時間對反應結果的影響。因此，本論文的研究為精確分析蛋白質修飾的一級結構變化提供了重要的研究方法，為真空干燥在實驗分析中的應用提供了重要參考。

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Study on the glycation of ovalbumin during vacuum drying with D－glucose using LC FT－ICR MS

TU Zong－cai1，WANG Hui1，LIU Cheng－mei1，LIU Guang－xian2，XIAO Hui3
(1.State Key Lab of Food Science and Technology of Nanchang University，Nanchang 330047，China;2.Food Research Centre，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang 330200，China;3.Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University，New York 10461，USA)

The glycation of ovalbumin during vacuum drying with D－Glucose was studied using LC FT－ICR mass spectrometry.The protein coverage was as high as 100%with pepsin digestion followed by LC FT－ICR MS analysis.A number of Lysines of ovalbumin including K47，56，62，182，190，323 and 370 were glycated with the reduced sugar by Maillard Reaction during vacuum drying.However，the Arginine and amido of N－terminal were not glycated by the reduced sugar.At the same time，CID－MS/MS/MS was used to determine if m/z 7863+was the new peak resulting from glycation，i.e.m/z7323+plus 162Da.This paper provided a new method to study protein modifications in the amino acid sequence，offered an important reference for the vacuum drying applications.

vacuum drying;glycation;ovalbumin;LC FT－ICR MS;pepsin

TS201.2

A

1002－0306(2011)06－0090－04

2011－03－22

涂宗財(1965－)，男，博士，教授，研究方向:食品生物大分子的改性。

國家自然科學基金項目(20976078);國家重點實驗室自由探索項目(SKLF－TS－200923)。