青春雙歧菌耐氧馴化及培養條件的響應面法優化

張 智，黃 放，王 闖，王振宇，2，*

(1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040;2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150001)

青春雙歧菌耐氧馴化及培養條件的響應面法優化

張 智1，黃 放1，王 闖1，王振宇1，2，*

(1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040;2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150001)

對一株青春雙歧桿菌進行耐氧馴化，通過有氧、無氧交替馴化法對出發菌株進行耐氧馴化，得到耐氧能力較強的青春雙歧桿菌菌株，在有氧靜止培養條件下活菌數可達到4.31×1011cfu/mL。對該耐氧菌株通過響應面法進行培養條件優化，確定培養耐氧青春雙歧桿菌的最佳條件:接種量5%，玉米糖化液濃度12.1°Bx，初始pH6.48，培養溫度37℃，發酵時間24h。在此條件下菌液最大OD值為1.819，此條件下培養的活菌數為3.05×1012cfu/mL。

青春雙歧桿菌，耐氧馴化，響應面法

雙歧桿菌是健康個體腸道中的優勢菌，高密度的雙歧桿菌菌群對維持宿主健康有著舉足輕重的意義［1－2］，它與人的一生始終保持著和諧的共生關系，其促進人體健康的有益作用遠遠超過其它乳酸菌。它是人體腸道內100多種細菌中典型的對人體有益無害細菌［3］，有抑制致病菌和腐敗菌、提供營養、提高免疫力、抗腫瘤等功能［4－7］。為解除厭氧培養雙歧桿菌對工業化生產要求的制約，降低生產成本，亟需對青春雙歧桿菌進行耐氧培養馴化，以及應用廉價并具有豐富營養價值的玉米為原料對其進行培養基的優化，進而對工業化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青春雙歧桿菌菌株 本實驗室保藏;活化培養基 鮮牛奶(市售);篩選培養基 MRS培養基;優化培養基 自制玉米汁培養基。

YQX－厭氧培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;DHG－9240型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;722S型可見分光光度計 上海精密儀器科技有限公司;電腦程控壓力蒸汽滅菌鍋

長春百奧生物儀器有限公司;SW－CJ－IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;ALC－210.2電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋、TDA－8002恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;85－2電磁攪拌器 哈爾濱科器醫療設備有限公司;雙目顯微鏡。

1.2 出發菌株選擇

采用平板稀釋分離法，將菌種的發酵液在合適的稀釋度下稀釋后涂布于分離平板，37℃厭氧培養48h(置于厭氧培養箱中，使用前用氮氣換氣兩次，并充入氫氣和二氧化碳混合氣體造成厭氧環境)，觀察菌落形態特征并挑取大的完整的菌落，進行革蘭氏染色和顯微鏡觀察，對可疑為雙歧桿菌的菌落，在厭氧條件下接種培養，再轉入牛奶發酵培養基中，37℃厭氧培養24h。然后在厭氧條件下繼續分離、純化，直至獲得純培養。

1.3 耐氧菌株篩選

先將純化好的幾株菌在厭氧條件下培養，然后在好氧條件下培養，24h傳一代，不斷增加好氧培養的時間，縮短厭氧培養的時間。并且在改變培養環境的同時，在裝液量(30mL)一定的條件下，逐漸增加培養器皿的容積，也就是增加培養基中菌與氧氣的接觸面積即由試管培養逐漸轉換為三角瓶培養，讓其逐漸適應有氧環境。

1.4 耐氧菌株生長曲線的測定

以2h為間隔，取樣稀釋25倍，以蒸餾水為對照，在波長600nm測其OD值，根據OD值和時間分別作厭氧菌株和耐氧菌株的菌體生長曲線。

1.5 耐氧菌株最適生長條件實驗

1.5.1 玉米糖化液濃度單因素 玉米粉糖化5h后，離心并過濾至澄清，分別以濃度為8、9、10、11、12、13、14、15°Bx做培養基，接種量為5%，初始pH為自然pH，37℃有氧培養至生長對數期，對其吸光度進行檢測。

1.5.2 接種量單因素 在上述單因素最好水平基礎上，分別接入1%、3%、5%、7%、9%、11%的菌種，自然pH，37℃有氧培養至生長對數期，對其吸光度進行檢測。

1.5.3 培養初始pH單因素 在上述單因素最好水平基礎上，初始pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0培養菌種，37℃培養至生長對數期，對其吸光度進行檢測。

1.5.4 培養溫度單因素 在上述單因素最好水平基礎上，分別在溫度為28、31、34、37、40、43、46℃下進行培養至生長對數期，對其吸光度進行檢測。

1.5.5 促生長因子單因素 在上述單因素最好水平基礎上，分別添加促生長因子，葡萄糖0.5%、低聚果糖0.5%、低聚木糖0.5%，酵母膏0.5%，大豆蛋白胨0.5%培養至生長對數期對其吸光度進行檢測。

1.6 響應面法優化培養條件

在單因素實驗結果的基礎上綜合考慮選取主要的三個因素:玉米糖化液濃度、初始pH、溫度為自變量利用響應面分析法(RSM)對其進行定量、定性分析。每個因素取三水平，以(－1，0，1)編碼，以吸光度為響應值，進行實驗設計。如表 1所示，采用MINITAB15軟件進行數據處理。

表1 因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 出發菌株的活化選擇

將實驗室保存的菌種接種到牛奶培養基中，厭氧條件37℃下培養24h，選取10－8、10－9、10－10三個稀釋度涂平板，厭氧條件37℃下培養24～48h，在MRS瓊脂平板上長出菌落。

觀察菌落特征，乳白色小菌落，圓形隆起，直徑大約1～2mm，表面粘稠較光滑，邊緣整齊，具有柔軟質地，易挑取。挑取具有如上特征的菌落進行革蘭氏染色和顯微鏡觀察，革蘭氏呈陽性，菌體為桿狀，長短不一，多數呈彎曲狀或V字形，不能游動，無芽孢和鞭毛，此為典型雙歧桿菌特征。

再挑取菌落并接種到牛奶培養基中培養，采用上述的方法涂平板觀察菌落特征，挑取較大的菌落保存，作為有氧馴化的出發菌株，將菌株接種到牛奶培養基中，在厭氧培養箱中培養，待其凝固后將試管口密封，放入0～4℃冰箱中保存。

2.2 耐氧菌株的篩選

2.2.1 交替馴化法 a.試管培養

b.三角瓶培養

2.2.2 耐氧能力測試 將青春雙歧桿菌在厭氧和有氧條件下分別進行液體培養和固體培養，得出結果如表2和表3所示。青春雙歧桿菌經牛奶液體培養，在厭氧條件下菌體為桿狀，長短不一，多數呈彎曲狀或V字型，為典型雙歧桿菌特征，經有氧條件下培養后，其特征無明顯變化，但菌體略有變細和著色不均勻現象。青春雙歧桿菌經MRS固體培養后，在厭氧和有氧條件下的菌落形態沒有變化，但厭氧條件下的菌落直徑要比有氧條件下的菌落大一些，并且長出菌落的時間要短的多。

有氧條件下青春雙歧活菌計數是 4.31×1011cfu/mL，厭氧條件下活菌數是5.12×1012cfu/mL，說明此菌已具有較好的耐氧能力，可以在三角瓶中靜止狀態下培養，但菌體生長狀態不如厭氧條件下旺盛，菌體體積較厭氧培養的菌體小。

通過平板培養的結果表明:在厭氧條件下，24h內就能長出菌落，而在有氧條件下則需要40～48h，這說明固體培養對氧的敏感性要強于液體培養。并且，固體培養是厭氧條件比有氧條件菌落直徑大，說明厭氧培養效果總體優于有氧培養，但此菌已具有一定的耐氧能力。

2.3 菌株生長曲線

用于發酵的菌體要求生長旺盛、強壯，因而要選用最佳菌種生長期——對數生長期的菌體。如圖1所示，無氧條件下青春雙歧桿菌培養18h時OD值最高，有氧條件下青春雙歧桿菌培養20h時OD值最高。則以后的實驗無氧條件培養時18h為培養終止時間，并選用此時的菌株作為檢測樣品，有氧條件培養時20h為培養終止時間，并選用此時的菌株作為檢測樣品。

表2 液體培養青春雙歧桿菌的特征

表3 固體培養青春雙歧桿菌的特征

圖1 青春雙歧桿菌在有氧和無氧條件下的生長曲線圖

2.4 耐氧菌株最適生長條件

2.4.1 玉米糖化液濃度對菌體生長的影響 實驗結果表明，玉米糖化液濃度對菌體生長有較大影響，如圖2所示，其OD值在12°Bx時達到最高，此時菌液濃度最大;當糖化液濃度再增大時，由于外界溶液濃度過高，會對細胞產生滲析作用從而影響菌體的生長，使菌液濃度降低。因此，選擇12°Bx作為今后實驗的玉米糖化液濃度。

圖2 玉米糖化液濃度對菌體生長的影響曲線圖

圖3 接種量對菌體生長的影響曲線圖

2.4.2 接種量對菌體生長的影響 以上實驗結果表明，隨著接種量的增加，菌液OD值逐漸增大，即菌液濃度逐漸增加，如圖3所示，因此可以得出，采用較大的接種量可以促進總菌數在接種后較短時間內恢復增長，縮短總菌數達到最高峰的時間，但過大的接種量會增加成本，且有可能帶入較多的代謝產物，造成最終產物提取困難，由以上數據確定本實驗接種量為5%。

2.4.3 初始pH對菌體生長的影響 實驗結果表明，菌體的生長狀況與初始pH大小關系較密切。如圖4所示，pH偏小或偏大都會影響菌體的生長，綜合考慮選用pH6.5為發酵初始值，此時的菌液OD值達到最高，即菌液濃度最大。

圖4 初始pH對菌體生長的影響曲線圖

2.4.4 培養溫度對菌體生長的影響 如圖5所示，結果表明，在37℃時菌液OD值達最大，即37℃是菌體最適宜生長溫度，在此條件下菌液能夠達到濃度最大。當溫度再增大時影響菌體的正常代謝，OD值逐漸下降，所以本實驗選取37℃為培養溫度。

圖5 培養溫度對菌體生長的影響曲線圖

2.5 響應面實驗

2.5.1 響應面實驗設計 采用MINITAB軟件Box－Behnken設計來模擬響應面模型，設計3因素3水平實驗，共15個實驗點，其中，13個析因實驗點，3個中心點實驗，中心點重復實驗用來估計實驗誤差。以3次平行實驗菌液吸光度平均OD值作響應值，做響應面實驗。各個因素和水平見表1，實驗設計及結果見表4。

由于各因素對青春雙歧桿菌生長的影響不是簡單的線性關系，為了更明確各因子對其的影響，采用MINTAB軟件對表2中數據進行多元回歸分析，得到如下多元二次響應面回歸模型:

Y=1.77+0.0260A－0.00050B－0.00250C－0.110A2－0.103B2－0.0950C2－0.0530A×B+0.0070A×C+0.0480B×C

表4 響應面實驗設計及結果

2.5.2 回歸分析 表5反映了回歸方程系數顯著性檢驗結果，糖化液濃度的二次項，初始pH的二次項以及培養溫度的二次項對菌體生長的影響效果在0.001水平達到極顯著，糖化液濃度與初始pH的交互項在0.01水平達到顯著，糖化液濃度的一次項以及初始pH與培養溫度的交互項對菌體生長的影響效果在0.1水平達到顯著，其余因素影響不顯著。注:“*”在0.1水平顯著;“**”在0.01水平顯著;“***”在0.001水平顯著;表6同。

表5 回歸系數顯著性分析

其決定系數R2=0.9774說明實驗值與預測值非常接近。如表6可知，二次回歸模型極顯著(P=0.001)，失擬相不顯著(P=0.203)，則說明該模型與實驗擬合良好，可以用于青春雙歧桿菌發酵分析和預測。方差分析表明，以上回歸方程較好地擬合了實驗數據(見表5、表6)。

表6 回歸方程檢驗結果

2.5.3 各因素交互作用的響應曲面圖 為了使各因素及其交互影響能有效地直觀反映，利用MINITAB15軟件程序作出響應曲面圖，見圖6～圖8，從三幅圖可以直觀地看出，三因素交互作用有其最大值。響應曲面的形狀可以反映出交互效應的強弱大小，曲面壁平緩表示兩交互作用不顯著，曲面壁陡峭表示兩交互作用顯著。

圖6結果顯示了培養溫度取中心水平時，糖化液濃度和初始pH對菌體生長影響的交互作用。從響應曲面壁較陡峭可知交互作用較顯著，糖化液濃度因素影響較顯著，在實驗水平范圍內隨著糖化液濃度的增加，菌液濃度呈先增加后減小的趨勢，在糖化液濃度較低時，初始pH對菌體生長的影響顯著，表現為先增加后減小的過程，在糖化液濃度取高水平時初始pH對菌體生長影響不大。從圖6可以看出，糖化液濃度為11.8～12.5°Bx，初始pH為6.25～7.10時，菌液OD值可達實驗的最大值。

圖6 菌液吸光度與糖化液濃度、初始pH的響應曲面圖

圖7結果顯示了初始pH取中心水平時，糖化液濃度和培養溫度對菌體生長影響的交互作用。從響應曲面壁較平緩可知，交互作用不顯著，糖化液濃度因素影響顯著，在實驗水平范圍內隨著糖化液濃度的增加菌液濃度呈先增加后減小的趨勢，在糖化液濃度較低時，培養溫度對菌體生長的影響顯著，表現為先增加后減小的過程，在糖化液濃度取高水平時，培養溫度對菌體生長影響不大。從圖7可以看出，糖化液濃度為 11.8～12.6°Bx，培養溫度為35.5～38.5℃時，菌液OD值可達實驗的最大值。

圖7 菌液吸光度與糖化液濃度、培養溫度的響應曲面圖

圖8結果顯示了糖化液濃度取中心水平時，初始pH和培養溫度對菌體生長影響的交互作用。從響應曲面壁較陡峭可知交互作用較顯著。在初始pH較低和較高時，培養溫度對菌體生長的影響顯著，在初始pH取中心水平時培養溫度對菌體生長影響不大;在培養溫度較低和較高時，初始pH對菌體生長的影響顯著，在培養溫度取中心水平時，初始pH對菌體生長影響不大。從圖8可以看出，初始pH為6.25～7.00，培養溫度為35.5～38.5℃時，菌液OD值可達實驗的最大值。

圖8 菌液吸光度與初始pH、培養溫度的響應曲面圖

2.5.4 培養條件最適組合 在獲得非線性回歸模型和響應面之后，為了求得最佳發酵條件，通過SAS軟件對數據及方程進行分析，可以得到最大活菌數時的最佳條件，即:A=0.1271、B=－0.0395、C=－0.0184，即玉米糖化液濃度為12.1271°Bx、初始pH為6.4903、培養溫度為36.9448℃，在此條件下培養菌液的響應面理論預測OD值可達1.852。

2.5.5 驗證實驗 為驗證響應面法的可靠性，對該優化條件進行驗證實驗，重復三次。綜合上述最優化條件和實際可操作性，按以下條件做驗證性實驗:玉米糖化液濃度為12.1°Bx，初始pH為6.48，培養溫度為36.9℃。實際菌液OD值為1.819，實際值比預測值誤差－1.81%，可見該模型能夠較好地預測實驗結果，可以為青春雙歧桿菌培養在工業化生產中應用提供技術依據。通過顯微鏡觀察及平板計數法觀察，在此最佳條件下的菌株培養20h后活菌數達到3.05×1012cfu/mL。

3 討論

本實驗經交替法馴化后，篩選出耐氧青春雙歧桿菌菌株，可以在有氧條件靜止狀態下培養，8h凝乳，培養24h，活菌數達到4.31×1011cfu/mL，厭氧培養效果總體優于有氧培養，但其具有較好的耐氧能力。

本研究經過對玉米糖化液濃度、接種量、初始pH、培養溫度、促生長因子等相關因素的單因素實驗和響應面綜合實驗，確定培養耐氧青春雙歧桿菌的最佳條件:接種量5%，玉米糖化液濃度12.1°Bx，初始pH6.48，培養溫度37℃，發酵時間20h。在此條件下菌液最大OD值為1.819，此條件下培養的活菌數為3.05×1012cfu/mL。

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［6］凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京:中國輕工業出版社，1999:68－80.

［7］孫記錄，賈英民，田洪濤，等.雙歧桿菌生長促進因子的研究進展［J］.食品工業科技，2003(8):110－112.

Domesticating oxytolerant Bifidobacterium adolescentis and optimizing condition of culture by response surface methodology

ZHANG Zhi1，HUANG Fang1，WANG Chuang1，WANG Zhen－yu1，2，*
(1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;2.College of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150001，China)

The Bifidobacterium adolescentis had been domesticated aerotolerant by cultivating with and without oxygen alternately.After being domesticated，it became so strong that it can multiply 4.31×1011cfu/mL with oxygen.The condition of culture was optimized through response surface method and the optimum culture conditions were obtained:5%of the Bifidobacterium adolescentis，12.1°Bx of the corn juice concentration，pH 6.48，fermentation temperature of 37℃，fermentation time of 24h，OD can get 1.819 and viable count was 3.05×1012cfu/mL.

Bifidobacterium adolescentis;oxygen－resistant domesticated;response surface methodology

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0208－05

2010－03－10 *通訊聯系人

張智(1964－)，女，教授，碩士生導師，研究方向:天然產物生物轉化。