發酵乳中ACE抑制肽生成的外部因素條件的研究

姜瞻梅，吳 剛，霍貴成，田 波

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030)

發酵乳中ACE抑制肽生成的外部因素條件的研究

姜瞻梅，吳 剛，霍貴成，田 波

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030)

探討了促進發酵乳中ACE抑制肽生成的外部因素條件。研究結果表明，菌株發酵凝乳(pH 4.7～5.0)后，產生肽量迅速積累，ACE抑制活性大幅度增強，產生的肽量與ACE抑制活性具有正相關性。添加乳清蛋白和酪蛋白可提高發酵乳中的肽含量，添加酪蛋白組更為突出;添加乳清蛋白組肽粉ACE抑制活性減弱，而添加酪蛋白組肽粉ACE抑制活性增強。與發酵溫度42℃相比，37℃發酵條件下有利于發酵乳ACE抑制肽生成;與4℃冷藏處理相比，37℃條件下保溫培養對提高ACE抑制活性和肽含量更為顯著(P＜0.01)，實驗結果為發酵法生產ACE抑制肽提供了可靠的技術依據。

ACE抑制活性，ACE抑制肽，發酵乳，影響因素

ACE抑制肽是一類具有ACE抑制活性的多肽物質，對ACE的親合度比血管緊張素Ⅰ或舒張激肽還要強，而且也較不易從ACE結合區釋放，從而阻礙ACE催化血管緊張素Ⅰ水解成為血管緊張素Ⅱ，以及催化舒緩激肽水解成為失活片段的兩種生化反應過程，起降血壓作用［1－2］。近年來，國外有許多關于發酵法制備乳源ACE抑制肽的研究報道，最早Yamamoto等［3］研究得出瑞士乳桿菌發酵乳的ACE抑制活性和肽含量比其它乳酸菌菌株高。隨后Nakamura等［4］以Lactobacillus.helveticus和 Saccharomyces.cerovisiae菌株作為乳發酵劑制成Calpis酸乳，并純化出兩個ACE抑制肽;相繼許多研究者報道了制備具有不同ACE抑制活性的酸乳［5－7］，同時也證實了酸乳的抗高血壓活性。但是，對于影響發酵乳中ACE抑制肽生成的關鍵因素和機理方面研究較少，不系統。因此，本文詳盡地研究影響發酵乳中ACE抑制肽生成外部因素，旨在為工業化生產具有強ACE抑制活性的酸乳制品提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌菌株 由乳品科學教育部重點實驗室提供;血管緊張素轉化酶(ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、OPA(鄰苯二甲醛) Sigma公司，美國;無抗脫脂乳粉 新西蘭進口。

XW－80A型旋渦混合器 上海醫科大學儀器廠;UV－2401PC型分光光度計 日本島津株式會社;Delta320 pH計 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;CS202型電熱保溫干燥箱 重慶實驗設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 具有ACE抑制活性的發酵乳制備 將活化后的 瑞 士 乳 桿 菌 KLDS1.0485 和 干 酪 乳 桿 菌KLDS1.0486凍干粉，以1%的接菌量，轉接至11%脫脂乳中，混勻后置37℃培養箱，培養至各菌株全部凝乳為止。將凝乳后的脫脂乳采用OPA法測定肽含量，同時采用高效液相色譜方法測定不同菌株發酵乳的ACE抑制活性。

1.2.2 發酵乳中ACE抑制活性的測定 本實驗在Wu等［8］的測定方法基礎上進行了修改，具體方法如下:將菌株發酵后的脫脂乳在6000×g離心20min，取上清液，加1mol/L NaOH調其pH為8.3，然后按照高效液相色譜法測定發酵乳ACE抑制活性。具體方法如下:取120μL馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)底物液，加入20μL抑制劑混合均勻，然后加入10μL ACE(血管緊張素轉化酶)酶液充分混合，在37℃條件下保溫60min后，再加入150μL的1mol/L HCl中止反應，得到反應液。該反應液用0.45μm濾膜過濾后在HPLC系統自動進樣分析。同時用10μL pH8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對照組。ACE抑制活性計算公式如下:

式中:M為空白對照組中馬尿酸的峰面積(mAU·s);N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積(mAU·s)。1.2.3 發酵乳中肽含量的測定 參照Church等［9］的方法，100mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑溶液中含有50mL 100mmol/L四硼酸鈉溶液、5mL 20%(wt/wt)SDS溶液、80mg OPA(溶于2mL甲醇)、200μL β－巰基乙醇。將發酵后的脫脂乳攪勻后取1mL，加入2mL 0.75mol/L三氯乙酸溶液，混勻。6000×g離心5min后，取上清液備用。取100μL雙蒸水，加入200μL 0.75mol/L三氯乙酸溶液、6mL OPA試劑后混勻，作為空白對照。取100μL樣品離心后的上清液，加入2mL OPA試劑，混勻后于340nm波長下檢測其吸光值。用胰胨作為標準品，配制梯度稀釋溶液。取100μL標準樣品，加入2mL OPA試劑，混勻后于340nm波長下檢測其吸光值。繪制氨基酸或肽濃度與吸光度的標準曲線，計算樣品中的肽含量。

2 結果與分析

2.1 單一菌株發酵特性

瑞士乳桿菌 KLDS1.0485和干酪乳桿菌KLDS1.0486在0～32h發酵過程中的pH與其ACE抑制活性或肽含量的變化關系見圖1和圖2。

圖1 瑞士乳桿菌KLDS1.0485發酵過程中pH與ACE抑制活性或肽含量的關系

圖2 干酪乳桿菌KLDS1.0486發酵過程中pH與ACE抑制活性或肽含量的關系

對圖1和圖2結果分析可知，在發酵初期，菌株產酸量小，也就是脫脂乳未凝乳前，發酵乳中的ACE抑制活性很弱，肽含量較低，并且保持較低水平幾乎不變或改變較小。但是當發酵乳的pH降至4.7～5.0時，開始凝乳以后，發酵乳中產生的肽量迅速積累，ACE抑制活性大幅度提高。這充分說明發酵乳凝乳后，可促進肽迅速生成，ACE抑制活性快速增強，另一方面也表明了乳酸菌菌株凝乳后有利于發酵乳中ACE抑制肽的產生。同時研究分析發現，單一菌株發酵脫脂乳后，發酵乳中肽含量增加，ACE抑制活性也隨著增強，這可證實發酵乳中的肽量與其ACE抑制活性具有一定的正相關性。

2.2 功能性添加物對發酵乳ACE抑制活性的影響

在脫脂乳培養基的基礎上，添加不同比例的酪蛋白和乳清蛋白，以組合菌株 KLDS1.0485和KLDS1.0486按照1∶1比例發酵，發酵完成后離心取乳清液冷凍干燥，干燥后稱取一定量的肽粉配成相同濃度的溶液，測定其ACE抑制活性。另外直接測定發酵后不同乳清蛋白和酪蛋白的發酵乳中肽含量。添加不同比例酪蛋白和乳清蛋白的組合菌株KLDS1.0485和KLDS1.0486發酵乳的ACE抑制活性和肽含量測定結果見圖3。

從圖3結果分析可知，培養基中隨著添加乳清蛋白比例增加，肽量逐漸增大，而得到的肽粉的ACE抑制活性逐漸減弱;這可能由于發酵菌株對乳清蛋白的利用率不高，發酵乳清液含有較多乳清蛋白，造成肽粉中的肽含量相對較少，以致ACE抑制活性降低。而培養基中隨著添加酪蛋白比例增加，發酵乳中產生的肽量比未添加酪蛋白組增加大約1倍(從4.91mg/mL增至8.51mg/mL)，得到肽粉的ACE抑制活性逐漸增強，這表明發酵乳中肽類主要來源是乳清蛋白和酪蛋白，尤其是后者。Leclerc等［10］研究發現，添加酪蛋白組的發酵乳比未添加對照組相比，有較強水解活性和ACE抑制活性，這與本實驗研究結果相一致。

圖3 功能性添加物對發酵乳ACE抑制活性的影響

2.3 發酵溫度條件對發酵乳ACE抑制活性的影響

在培養溫度為 37℃ 和 42℃條件下由菌株KLDS1.0485和菌株KLDS1.0486共同發酵凝乳后，培養相同時間取出，得到不同培養溫度條件下發酵乳的ACE抑制活性和肽含量見表1。

表1 發酵溫度對發酵乳ACE抑制活性的影響(ˉX±SE)

從表1的T檢驗結果證實，培養溫度為37℃與42℃相比，37℃條件下能極顯著地提高發酵乳的ACE抑制活性和肽含量(P＜0.01)，這說明37℃條件下有利于組合菌株KLDS1.0485+KLDS1.0486發酵乳中的ACE抑制肽的生成。

2.4 貯存條件對發酵乳ACE抑制活性的影響

采用組合菌株KLDS1.0485+KLDS1.0486發酵脫脂乳制得發酵乳，將其分別在4℃冷藏72h和在37℃保溫72h后，測定發酵乳中肽含量和發酵乳清中ACE抑制活性，結果如表2。

表2 貯存溫度對發酵乳ACE抑制活性的影響(ˉX±SE)

表2分析結果表明，與對照組相比，4℃冷藏處理和37℃條件下保溫發酵都可提高發酵乳的ACE抑制活性和肽含量(P＜0.01)，但與4℃冷藏處理相比，37℃條件下保溫發酵培養對提高ACE抑制活性和肽含量更為顯著(P＜0.01)。

3 結論

單一菌株發酵特性證實，凝乳(pH 4.7～5.0)后ACE抑制活性快速增強和肽量迅速積累，肽含量與ACE抑制活性具有正相關性。明確添加乳清蛋白和酪蛋白對發酵乳ACE抑制活性的影響。37℃發酵條件下有利于發酵乳ACE抑制肽生成;與4℃冷藏處理相比，37℃條件下保溫發酵培養對提高ACE抑制活性和肽含量更為顯著(P＜0.01)。

［1］Pihlanto－Leppala A，Rokka T，Korhonen H.Angiotensin IConverting Enzyme Inhibitory Peptides Derived from Bovine Milk Proteins［J］.International Dairy Journal，1998，8:325－331.

［2］Nakamura Y，masuda O，Takano T.Decrease of tissue angiotensin－I－converting enzyme activity upon feeding sour milk in spontaneous hypertensive rats［J］.Biosci Biotech Biochen，1996，60(3):488－489.

［3］Yamamoto N，Akino A，Takano T.Antihypertensive Effect of the Peptides Derived from Casein by an Extracellular Proteinase from Lactobacillus helveticus CP790［J］.J Dairy Science，1994，77:917－922.

［4］Nakamura Y，Yamamoto N，Sakai K，et al.Purification and Characterization of Angiotensin I－Converting Enzyme Ihibitors from Sour Milk［J］.J Dairy Science，1995，78:777－783.

［5］YamamotoN，MaenoM，TakanoT.Purification and characterization of an antihypertensive peptide from a ypghurtlike product fermented by Lactobacillus helveticus CPN4［J］.J Dairy Science，1999，82:1388－1393.

［6］Minervini F，Algron F，Rizzello C G，et al.AngiotensinI－converting enzyme－inhibitory and antibacterial peptides from Lactobacillus helveticus PR4 proteinase－Hydrolyzed caseins of milk from six species［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69(9):5297－5305.

［7］Geerlings A，Villar I C，Hidalgo Zarco F，et al.Identification and Characterization of Novel Angiotensin－Converting Enzyme Inhibitors Obtained from Goat Milk［J］.J Dairy Science，2006，89:3326－3335.

［8］Wu J P，Aluko R E，Muir A D.Imprived method for direct high－performance liquid chromatography assay of angiotensinconverting enzyme－ catalyzed reactions［J］.Journal of Chromatography A，2002，950:125－130.

［9］ChurchF C，SwaisgoodH E，PorterD H，etal.Spectrophotometric assay using o － phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated mil proteins［J］.J Dairy Science，1983，66:1219－1227.

［10］Leclerc P L，G authier S F，Bachelard H，etal.Antihypertensive activity of casein－entriched milk fermented by Lactobacillus helveticus［J］.International Dairy Journal，2002，12:995－1004.

Study on external conditions of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide derived from fermented milk

JIANG Zhan－mei，WU Gang，HUO Gui－cheng，TIAN Bo
(Key Lab of Dairy Science(Northeast Agricultural University)，Ministry of Education，Food Science＆Technology of Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

External factor condition of antihypertensive peptide derived from fermented milk were studied.During the fermentation experiment of single latic acid bacteria，when the pH range from 4.7 to 5.0 in the fermented milk，peptide concentration increased quickly and ACE inhibitory activity was made stronger.And peptdie and ACE inhibitory activity were with positive correlation.Peptide contents increased in fermented milk with fortified casein and whey，especially fast for the latter.ACE inhibitory activity decreased in the added whey fermented milk，but increased in the added casein fermented milk.Effects of fermentation temperature and preservation temperature were studied.Compared with fermentation at 42℃，there were more antihypertensive peptide production at 37℃.At the same time，compared with preservation at 4℃，there were more ACE activities and higher peptide contents in fermented milk at 37℃(P＜0.01).That was provided with technique basis for production of antihypertensive peptide by fermentation.Key words:ACE inhibitory activity;ACE inhibitory peptide;fermented milk;critical factors

TS252.54

A

1002－0306(2011)04－0106－03

2009－12－02

姜瞻梅(1976－)，女，博士，副教授，研究方向:乳品加工與畜產品。

2009年黑龍江省教育廳科學技術研究項目(11541020)。