白腐真菌產木聚糖酶發酵條件的優化及酶學性質研究

岳曉禹，張恒業，劉艷娟，牛天貴，劉相東

(1.鄭州牧業工程高等專科學校質檢系，河南鄭州450011;2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083;3.河南商業高等專科學校，河南鄭州450044;4.中國農業大學工學院，北京100083)

白腐真菌產木聚糖酶發酵條件的優化及酶學性質研究

岳曉禹1，2，張恒業1，劉艷娟3，牛天貴2，劉相東4

(1.鄭州牧業工程高等專科學校質檢系，河南鄭州450011;2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083;3.河南商業高等專科學校，河南鄭州450044;4.中國農業大學工學院，北京100083)

通過正交實驗對白腐真菌Pleurotus ostreatus SYJ042產酶條件進行了優化，研究了該酶的酶學性質。結果表明:最適發酵條件為:碳源為5%的麩皮和玉米芯(1∶1)，氮源為0.5%的蛋白胨，接種量為每50mL發酵液接4塊菌絲塊，發酵時間為8.5d。該酶的最適溫度是50℃，最適pH為5.4;Zn2+、Ca2+對酶活性影響較小;Ag+、MnO2－4影響較大。

木聚糖酶，發酵條件，酶學性質

木聚糖是木糖殘基以β－1，4木糖苷鍵連接而構成的，是植物細胞壁中的半纖維素多糖的主要成分，約占植物碳水化合物總量的1/3，在自然界中是繼纖維素之后的含量第二豐富的再生生物資源［1］。木聚糖酶是能夠水解木聚糖的一個復合酶系的總稱，主要的酶包括內切木聚糖酶(1，4－β－D木聚糖水解酶，EC3.2.1.8)和 β－木糖苷酶(1，4－β－D木聚糖，木寡糖水解酶)［2］。由于木聚糖酶在半纖維多聚糖資源的利用以及工業應用方面的巨大潛力，其廣泛應用于飼料、食品、造紙、紡織和釀造工業，是一種重要的工業用酶［3］。國內已有不少研究者對鏈霉菌［4］、曲霉［5］、黑曲霉［6－7］、酵母［8］、木霉［9］等真菌及芽孢桿菌［10－11］等細菌的木聚糖酶進行了研究。國外很多研究者也進行了微生物產木聚糖酶的生產及應用研究［12－15］。但很少有采用白腐真菌作為木聚糖酶的來源進行研究，而白腐真菌是安全且具有很高的營養價值［16］，并且其中的許多代謝物是制藥、食品的重要來源［17］。本實驗利用白腐真菌作為提取木聚糖酶的微生物來源，以實驗室分離保存的白腐真菌(Pleurotus ostreatus SYJ042)為研究菌種，優化其產木聚糖酶條件，并研究其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1%木聚糖 將1.000g木聚糖(Oat spelts，購自Sigma公司)加熱溶解于100mL蒸餾水中定容后，放于冰箱中備用;緩沖液 磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制堿性緩沖液，檸檬酸和檸檬酸鈉配制的酸性緩沖液;DNS試劑 稱取10g 3，5－二硝基水楊酸溶于水中，全部溶解后，加入20g NaOH、200g酒石酸鈉，加入蒸餾水，使總體積至500mL左右，加熱溶解后，加2g苯酚、0.5g無水亞硫酸鈉，加熱攪拌至全部溶解，冷卻，用水稀釋至1000mL，儲于棕色瓶中，1周后使用。

UV－2800A紫外可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司;恒溫搖床培養箱 東西儀(北京)科技有限公司;生化培養箱 上海實驗儀器廠;超凈工作臺 上海人和科學儀器有限公司。

1.2 培養基組成

1.2.1 菌種篩選培養基 麩皮5.0g，蛋白胨0.2g，瓊脂1.8g，Mandels鹽溶液100mL［18］。［Mandels氏組成(g/1000mL):NaNO43.0g，KH2PO43.0g，MgSO40.5g，CaCl20.5g，FeSO4·7H2O 7.5×10－3g，MnSO4·H2O 2.5×10－3g，ZnSO4·7H2O2.0×10－3g］。

1.2.2 初始發酵培養基 5.0g麩皮，0.2g蛋白胨，另外，添加Mandels鹽溶液100mL(組成同上)。

1.2.3 發酵用液體培養基 2.5g麩皮，2.5g玉米芯，0.8g蛋白胨，添加 Mandels鹽溶液100mL(組成同上)。

1.3 培養方法

實驗過程中，經過試管斜面培養、平板擴大培養和搖瓶液體發酵培養三個階段組成。從菌種中接入斜面試管中，25℃生長7d后放在4℃條件貯存備用。然后將試管中培養好的一級菌種接入到平皿培養基中，將平板25℃條件下培養7d，長滿平板后用于搖瓶液體培養。150mL三角瓶裝液量50mL，接入4塊0.25cm2菌塊，置于旋轉式搖床(轉速為160r/min)上，26℃培養120h。

1.4 木聚糖酶酶活的測定方法和酶活定義

木聚糖酶酶活測定采用DNS法［19］。發酵液經6000r/min離心15min后，取上清液作為測定酶液。取1mL酶液，加入到4mL蒸餾水中(稀釋5倍，不同批次酶液稀釋倍數不同)，分成2份，其中1份沸水浴中煮沸20min，滅活作為空白。另外1份作為測定酶液。取0.2mL酶液(滅活酶液作為空白)加入到0.2mol/L、pH 7.0磷酸緩沖液配制的1%木聚糖溶液中，50℃反應15min，煮沸10min，流水冷卻后，加入5.0mL蒸餾水，540nm條件下比色測吸光度。DNS法測定還原糖是以木糖為標準，在上述條件下，每分鐘產生的還原糖相當于1μmol木糖的所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.5 正交實驗

參考岳曉禹等單因素實驗結果［20］，選發酵時間、接種量、氮源和碳源這4個重要的影響因素作四因素三水平的正交實驗，測定酶活從而得出最佳的培養條件。

1.6 酶液處理

1.6.1 硫酸銨沉淀 采用固體硫酸銨法。分別取20mL酶液，室溫下，緩緩加入硫酸銨各2.26、3.50、4.84、6.24、7.80、9.48、11.20g，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶解，飽和度分別達到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。再放于4℃下靜置過夜，離心收集沉淀。將沉淀溶解于0.2mol/L、pH5.4檸檬酸緩沖液，測酶活及蛋白含量。計算酶活回收率和酶比活，得出合適的硫酸銨飽和度。

1.6.2 酶液除鹽 用中空纖維超濾器濃縮酶液，截留分子量為8000Da，工作壓力為0.12MPa，將酶液濃縮、除鹽。

1.7 木聚糖酶學性質研究

1.7.1 酶的最適溫度及熱穩定性 調不同的水浴溫度分別為30、35、40、45、50、55、60、70、80℃。取混勻的2.8mL反應體系(1mL 1%木聚糖和1.8mL pH5.4的檸檬酸緩沖溶液)，于不同溫度下保持10min，然后按本文的測酶活方法，測相應酶液的OD540，再計算成相應酶活單位，每個處理3個重復，取其平均值。以得到的各個酶活為縱軸，以不同反應溫度為橫軸作圖，得出最適溫度。

調不同的水浴溫度為30、40、50、60、70℃。取0.2mL適當稀釋的酶液，于不同溫度下靜置10min后取出，用流水冷卻，全部熱處理結束后，按本文的測酶活方法，加入預熱至50℃的2.8mL反應體系，測相應的OD540，再計算成相應的剩余酶活力，每個樣3次重復，取其平均值。以水浴溫度為橫坐標，以相對剩余酶活力為縱坐標作圖，從而得出酶的熱穩定范圍。1.7.2 酶的最適pH及pH穩定性 取0.5mL酶液與pH分別為3、4、4.6、5、6、7、8的0.5mL緩沖溶液混勻，靜置15min后，適當稀釋，從中取出0.2mL酶液，按本文的測酶活方法測相應的OD540nm處的吸光度。再計算出相應酶活，每個樣3次重復，取其平均值。以酶活為縱軸，以不同緩沖液的pH為橫軸作圖，得出最適pH。

將0.5mL酶液與pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的0.5mL緩沖溶液混勻，4℃下靜置1h，再加入0.5mL pH5.4的緩沖溶液混勻，再室溫靜置10min，適當稀釋后，從中取出0.2mL酶液，按本文的測酶活的方法測相應OD540，再計算出相應剩余酶活。每個處理3次重復，取其平均值。以不同pH為橫坐標，以相對剩余酶活力為縱坐標作圖，得出酶的pH穩定范圍。

1.7.3 金屬離子對酶活的影響 將濃縮酶液于20mmol/L pH5.4的buffer中透析24h，檢查活性有無明顯變化。選取不同的金屬離子，加入處理好的酶液中，使金屬離子的終濃度為8mmol/L，振蕩、室溫下靜置15min，按本文的測酶活方法，得到相應的剩余酶活力。以不同金屬離子為橫坐標，以相對剩余酶活力為縱坐標作圖，從而得出部分金屬離子對酶活的影響。

2 結果與討論

2.1 正交實驗

由表2結果可知，各因素對酶活的影響主次順序為氮源>接種量>發酵時間>碳源。最優化配方是A2B3C2D3，但這個組合在實驗中沒有出現。由實驗得出的最佳處理是A2B3C2D2，重復這兩個組合的處理，證實最佳配方為A2B3C2D3，即碳源為5%的麩皮和玉米芯(1∶1)，氮源為0.5%的蛋白胨，接種量為每50mL發酵液接4塊菌絲塊，發酵時間為8.5d。其它條件是初始pH為6.0，通氣量為發酵液占容積的1/3。

表3 硫酸銨沉淀實驗結果

表1 實驗因素及水平

表2 正交實驗結果

2.2 硫酸銨沉淀結果

從表3可知，隨著硫酸銨飽和度的增加，析出的沉淀物中的酶活回收率逐漸增加，到70%時最高，但相應的酶比活是60%硫酸銨飽和度時最高，達到26.88U/mg，這可能是因為70%飽和度時雜蛋白較多的緣故。而60%和70%時的酶活回收率差別不是很大，所以采用60%飽和度。

用中空纖維超濾器將濃縮酶液除鹽備用，截留分子量為8000Da，工作壓力為0.12MPa。

2.3 木聚糖酶特性研究

2.3.1 酶的最適溫度及熱穩定性 從圖1可以看出，在采用的測定條件下，該酶的最適作用溫度是50℃。在低于最適溫度時，酶活性隨溫度的升高而增強;在高于最適作用溫度時，酶活性隨溫度的升高而降低。在60℃時有64.2%殘余酶活(設50℃時的酶活為100%)，80℃時殘余酶活降到43.6%。

從圖2可見，在測定條件下，該酶在30℃處理90min以內酶活殘留都保持在89%以上，在40℃下，處理90min以內酶活殘留也基本都保持在85%以上，而在50℃處理15min殘余酶活在58.7%，處理30、60、90min殘余酶活分別為 46.7%、41.2%、30.6%，在60℃下處理15min殘余酶活僅剩20.3%，處理60、90min酶活基本全部損失，70℃處理15min殘余酶活僅剩11.4%，此后延長處理時間酶活也基本全部損失，可見在低于40℃條件下該酶較穩定。說明該酶對溫度很敏感，抗高溫的能力較弱。

圖1 酶的最適溫度

圖2 酶的熱穩定性

2.3.2 酶的最適pH和pH的穩定性 每種微生物都有其最適pH和一定的pH范圍。最適pH實驗結果見圖3，可以得出實驗所得木聚糖酶的最適作用pH為5.4。

圖3 酶的最適pH

pH的穩定性實驗結果如圖4，可以得出該木聚糖酶在pH3.0～11.0之間處理1h后恢復至pH5.4，酶活性均可恢復至85%以上，說明該酶對pH不敏感，對pH的穩定性較強。

2.3.3 不同金屬離子對酶活的影響 用幾種不同金屬離子處理酶液后測定木聚糖酶活性，見圖5。結果顯示，在8mmol/L濃度下，所選取的幾種金屬離子對酶活性都有影響，Zn2+、Ca2+影響較小，酶活殘留仍在80%以上;Ag+、MnO24－對酶活性影響較大，殘留酶活分別為58.7%和13.4%。

圖4 酶的pH穩定性

圖5 金屬離子對酶活的影響

3 結論

本研究的對象是白腐真菌，優化了該菌株的木聚糖酶產酶條件，并對其酶活性質進行了研究。該菌株產木聚糖酶的最適發酵條件為:碳源為5%的麩皮和玉米芯(1∶1)，氮源為0.5%的蛋白胨，培養溫度為25℃，接種量為每50mL發酵液接4塊菌絲塊，發酵時間為8.5d，初始pH為6.0，通氣量為發酵液占容積的1/3。酶液的硫酸銨沉淀采用60%飽和度時，所得的酶比活最高，達到26.88U/mg。在采用的測定條件下，該酶的最適作用溫度是50℃;該酶對溫度很敏感，抗高溫的能力較弱，在低于40℃條件下，該酶較穩定。最適作用pH為5.4;該酶對pH不敏感，對pH的穩定性較強，在pH3.0～11.0之間處理1h后恢復至pH5.4，酶活性均可恢復至85%以上。金屬離子在8mmol/L濃度下，對酶活性都有影響，Zn2+、Ca2+影響較小，酶活殘留仍在80%以上;Ag+、MnO24－對酶活性影響較大，殘留酶活分別為58.7%和13.4%。

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Study on the optimization of xylanase fermentation conditions by white rot fungi and the enzymological properties

YUE Xiao－yu1，2，ZHANG Heng－ye1，LIU Yan－juan3，NIU Tian－gui2，LIU Xiang－dong4
(1.Department of Quality Detection and Management of Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering，Zhengzhou 450011，China;2.Food Science＆Nutrition Engineering College of China Agriculture University，Beijing 100083，China;3.Henan Business College，Zhengzhou 450044，China;4.Technical Institute of China Agriculture University，Beijing 100083，China)

By the orthogonal test，the optimal fermented condition of xylanase secretion by white rot fungi was obtained:2.5%wheat bran+2.5%corn cob，0.5% peptone，4 pieces per 50mL liquid volume，8.5d.By the experimental method in the thesis，some properties of the xylanase were obtained:the optimal temperature was at 50℃.The optimal pH was 5.4.Ag+and MnO2－4evidently impacted on the xylanase activity.

xylanase;fermented conditions;properties

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0197－04

2010－10－08

岳曉禹(1974－)，男，博士研究生，講師，研究方向:食品微生物。

鄭州牧專博士科研啟動資金資助項目。