膜技術純化大豆糖蜜發酵液的研究

趙 華

(北京工商大學，北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京100048)

膜技術純化大豆糖蜜發酵液的研究

趙 華

(北京工商大學，北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京100048)

利用膜技術去除大豆糖蜜發酵液中的蛋白質和脂肪成分，并通過納濾濃縮發酵液，提高低聚糖的純度。通過單因素變量法，即超濾膜截留分子量、透析比、pH和反應溫度的變化對大豆蜜糖發酵液中蛋白、脂肪的去除效果進行了研究。研究結果表明:超濾膜截留分子量為10000Da，透析比為3∶1，pH=7.0，反應溫度為室溫的條件下對大豆蜜糖發酵液中蛋白質和脂肪去除效果最好。

大豆糖蜜發酵液，膜技術，低聚糖，脂肪，蛋白質

大豆糖蜜是以脫脂大豆粕為原料，醇法制備大豆濃縮蛋白過程中產生的副產品［1－3］。大豆糖蜜呈棕色，性粘稠且具有微甜的風味。大豆糖蜜的主要成分為糖類，如固形物含量為50%的大豆糖蜜中一般含有36%的糖類、6%的蛋白質、5%的脂肪及3%的灰分［4－5］。大豆糖蜜發酵液是大豆糖蜜通過微生物發酵去除了蔗糖后剩下的液體，其中的主要成分是大豆低聚糖，如棉子糖和水蘇糖等。大豆低聚糖具有安全、穩定、甜度低和熱值低等特性，而且大豆低聚糖對人體具有特殊的保健作用，它在人體內可促使腸道雙歧桿菌增殖，從而抑制體內腐敗菌的繁殖，具有提高人體免疫力，延緩衰老的作用，因而作為功能性食品基料被廣泛應用。利用膜分離技術可以純化大豆糖蜜發酵液［6－8］。膜分離技術是近代發展起來的一項高新技術，主要用于凈化、濃縮、分級大分子或細小膠體物。超濾技術由于其工藝簡單、能耗低、分離完全等優點，已經在食品、醫藥、水處理以及新興的生物技術等領域獲得了廣泛的應用［9－11］。納濾介于超濾與反滲透之間，集分離純化與濃縮功能于一身，此外，它還具有節能及環境友好等特點，是目前國內外學者研究的熱點［12－14］。本實驗將超濾膜技術運用于純化大豆糖蜜發酵液，去除蛋白質和脂肪，并通過納濾濃縮發酵液，來提高低聚糖的純度。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大豆糖蜜發酵液(粘稠液體) 大豆糖蜜經過釀酒酵母C發酵后的溶液，實驗室自制;釀酒酵母C(Saccharomyces cerevisiae) 購自CICC;濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、氫氧化鈉、乙醚、石油醚、無水乙醇等均為分析純;牛血清蛋白(分子量為68000)、VB12(分子量為 1355.38)、氧化性谷胱甘肽(分子量為612.63) 均由北京萊博生物實驗材料研究所提供。

膜分離裝置、中空纖維超濾膜(截留相對分子量MWCO為10000、30000、100000Da，最大進口壓力0.2MPa，使用溫度5～45℃，酸堿度pH2～13)、納濾膜(截留相對分子量為500Da) 均為天邦膜技術國家工程研究中心有限公司提供;PHS－30型pH計 上海精科雷磁;高效液相色譜儀 北京島津醫療器械有限公司;手持糖度計 北京陽光億事達貿易有限公司;KQ250DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;水環式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要成分分析方法 蛋白質含量的測定:凱氏定氮法［15］;總脂的測定:堿式乙醚法;膜通量的測定:以單位時間得到的透過液體積計量;低聚糖的HPLC檢測條件確定為:Hypersil－NH2柱(250mm×4.6mm，5μm);示差檢測器;流動相為乙腈∶水=70∶30(V/V);流速:1mL/min;柱溫:30℃;進樣量:10μL。

1.2.2 大豆糖蜜中蛋白分子量分布的測定 將大豆糖蜜發酵溶液和水以100g∶1L的比例配制，過濾，濾液用凝膠色譜柱進行分離，收集對應于層析圖譜中各個吸收峰的洗脫液，分別進行分子量的測定。

1.2.3 糖分的測定 將大豆糖蜜發酵溶液以3500r/min離心5min，取3mL上清液，加入7mL無水乙醇，混合均勻，離心取上清液加2‰的活性炭對糖液進行脫色，加熱攪拌30min，趁熱過濾，濾液稀釋至折光為2.0Brix后，經0.22μm的微孔濾膜過濾得到待分析糖液，然后用HPLC法對糖液進行檢測。用面積歸一化法計算低聚糖的純度。

1.2.4 超濾工藝的研究

1.2.4.1 大豆糖蜜發酵液的預處理 將大豆糖蜜發酵溶液和水以100g∶1L的比例配制，待充分溶解混勻后，用鹽酸調pH4.0或7.0，然后以轉速4000r/min離心分離20min，取上清液作為超濾研究的原料。

1.2.4.2 膜過濾工藝條件 為考察透過液中總糖濃度隨超濾時間的變化情況，分別在固定時間段內取樣并測定折光值，并在超濾結束后分別測定透過液和截留液的可溶性固形物含量。

為了提高糖分的透過率，采用了內壓式切向流過濾方式，即在過濾過程中，只有部分水分透過超濾膜，另一部分水分與大分子雜質等一起形成濃縮液從超濾膜的另外端排出。超濾過程中，當料液體積減少而濃度提高到一定程度后加水稀釋，再進行超濾。具體操作可視透過速度顯著降低時，分多次加入等體積的水繼續超濾，直至透過液中可溶性固形物含量降至0.1Brix以下終止過濾。

1.2.4.3 膜原件的清洗 正洗:無壓力條件下，控制蠕動泵轉速90r/min，用純凈水沖洗約10min。反洗:用1L 5%氫氧化鈉溶液沖洗，再用純凈水清洗至中性。

1.2.5 納濾工藝的研究 納濾是介于反滲透和超濾之間的膜分離過程。納濾膜多為荷電膜，故除可截留糖和有機小分子外，還可通過膜電荷與溶質電荷間的作用排斥二價鹽和解離的有機酸。它是以壓力差為推動力，用復合于微孔基膜上，具有納米級孔徑的超薄分離層對大分子和小分子物質進行分離，可通過一種操作同時完成滲析和濃縮的兩個工藝過程［16］。

實驗以大豆糖蜜發酵液超濾后的透過液作為原料，依然采用了內壓式切向流過濾的方式，分析透過液和濃縮液成分變化來衡量納濾濃縮是否可行。

2 結果與討論

2.1 大豆糖蜜及發酵液中脂肪蛋白含量

為了考察料液處理過程中組成變化，對預處理前后大豆糖蜜及發酵液蛋白和脂肪含量進行了測試。預處理前后大豆糖蜜及發酵液中蛋白含量質量分數如表1所示，大豆糖蜜及發酵液中脂肪含量質量分數分別為0.45%和0.098%。

表1 預處理前后大豆糖蜜及發酵液中蛋白含量質量分數(%)

由此可知，大豆糖蜜原液或發酵液中主要雜質為雜蛋白，后續實驗重點去除蛋白質，脂肪只作為次要考慮因素。

2.2 大豆糖蜜發酵液中蛋白分子量分布

標樣色譜圖如圖1所示。對于凝膠柱，分子量越大越不容易吸附，所以保留時間越短。

圖2是發酵液原液樣品色譜圖。可以看出，發酵液原液樣品保留時間為10.883min，說明它的分子量低于谷胱甘肽，即小于612.63Da。根據相關文獻得知，大豆糖蜜中蛋白有大分子的蛋白和一些分子量較低的球蛋白和多肽及一些酚類等，目前工業化應用成熟的超濾膜截留分子量都在10000Da以上。

圖2 樣品色譜峰

2.3 超濾膜的選擇

超濾的目的主要是為了除去雜蛋白。根據大豆糖蜜分子量分布的相關資料，共選用截留分子為10000、30000、100000Da的中空纖維膜進行預實驗，實驗中料液的pH為7.0，在室溫下進行。

根據文獻資料和實驗室條件選擇實驗參數進行預實驗。泵速:90r/min;原液量:1000mL;透析比:2100/1000;流量:約22mL/min。

2.3.1 不同截留分子量膜的通透性比較 采用不同截留分子量的超濾膜對料液進行過濾，透過液體積隨時間變化如圖3所示。

圖3 不同截留分子量的膜過濾透過液體積隨時間的變化

采用不同截留分子量的超濾膜對料液進行過濾，透過液中可溶性固形物含量隨時間變化如圖4所示。

圖4 不同截留分子量的膜過濾透過液中可溶性固形物含量隨時間的變化

實驗結果表明，超濾過程中膜通量在150min時仍可維持恒定數值，說明實驗采用的內壓式切向流過濾方式適合于大豆糖蜜發酵液的分離;選用3種不同截留分子量的超濾膜進行過濾時，膜通量及透過液中的可溶性固形物含量沒有明顯區別。

2.3.2 過濾前后低聚糖成分變化 超濾前大豆糖蜜發酵液的HPLC譜如圖5所示，選用3種不同截留分子量的超濾膜過濾后料液的HPLC譜如圖6～圖8所示。

圖5 超濾前糖蜜發酵液HPLC圖

上述實驗結果表明，過濾前后低聚糖含量無明顯變化，且MWCO越小，除雜效果越好，所以選擇截留分子量為10000Da的中空纖維膜去除雜蛋白和脂肪。

圖6 MWCO100000膜超濾后糖蜜發酵液HPLC圖

圖7 MWCO30000膜超濾后糖蜜發酵液HPLC圖

圖8 MWCO10000膜超濾后糖蜜發酵液HPLC圖

2.4 透析比和pH對膜過濾過程的影響

實驗過程力求維持通量恒定，所以當通量開始明顯下降時加入與殘留液等體積的純凈水，直至過濾完成(透過液折光為0Brix)，所加入的水量約為原液的三倍，所以，最終確定透析比為3∶1。而在pH=7.0和pH=4.0條件下分別測定每10min得到透過液的體積，其流量變化如圖9。

圖9 不同pH條件下每10min透過液體積隨時間的變化

由圖9可知，pH對膜通量有著較大的影響，在pH為4.0條件下，通量迅速下降，加入純凈水稀釋后才有所恢復，而在中性pH為7.0條件下，膜通量的下降得較少，經分析這可能是因為處于等電點時，蛋白質分子很易沉積在膜表面，使透過阻力增加，透過通量下降。所以實驗中將預處理后的大豆糖蜜發酵液的pH調回中性后再進入超濾膜過濾。

2.5 料液溫度對膜過濾過程的影響

根據膜的溫度承受范圍，分別控制溫度為20、30、40℃，觀察膜流量變化，結果如圖10所示。可知溫度對膜過濾過程的影響很小，綜合成本等考慮，選擇在室溫條件下進行實驗。

圖10 不同溫度條件下每10min透過液體積隨時間的變化

2.6 在優化條件下大豆糖蜜發酵液中蛋白脂肪去除效果

經過以上多次單因素實驗，選定膜過濾相關參數條件為:膜截留分子量為10000Da，室溫，大豆糖蜜發酵液稀釋液pH=7.0，透析比為3∶1。經過濾后雜蛋白和脂肪含量變化如表2所示。

表2 膜過濾前后的蛋白質和脂肪含量

2.7 納濾濃縮工藝的初步探索

用截留分子量為500Da的納濾設備處理超濾好的透過液，圖11為納濾前的溶液、納濾濃縮液和納濾透過液的HPLC圖。由圖中可以看出，納濾前后的溶液的低聚糖成分無顯著變化，透過液中無糖分，納濾達到了濃縮糖液的效果。最終將膜過濾后的糖蜜發酵液濃縮至45Brix，以便下一步工業色譜分離糖液。

圖11 納濾處理前后糖分變化的HPLC圖

3 結論

大豆糖蜜發酵液中脂肪含量不高，且經膜(10000 dalton膜組件)過濾后截留效果能達到99%的去除率。大豆糖蜜發酵液中蛋白質經膜過濾后截留率很低，經膜過濾后能達到36%的去除率，還需要進一步研究，確定蛋白質在大豆糖蜜中的存在形式。

研究結果表明:超濾膜截留分子量為10000Da，透析比為3∶1，大豆糖蜜發酵液稀釋液pH=7.0，反應溫度為室溫的條件下，大豆蜜糖發酵液中蛋白、脂肪去除效果最好。經納濾處理后有效低聚糖成分無損失，濃縮方法可行。

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Purification of soybean molasses fermentation through membrane technology

ZHAO Hua
(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

The purpose of the project was to increase the purity of oligosaccharides by membrane technology to remove soybean molasses fermentation of protein and fat content，fermenting broth by nanofiltration.The single factor variables，namely，membrane molecular weight cutoff dialysis ratio，pH and reaction temperature on the fermentation of soybean protein in honey，fat removal were studied.The results showed that ultrafiltration membrane MWCO(molecular weight cutoff)of 10000Da，dialysis ratio of 3∶1，pH of 7.0 and room temperature were the best reaction conditions on the removal of honey fermentation of soybean protein and fat.That improved the product purity of oligosaccharides best.

soybean molasses fermentation;membrane technology;oligosaccharide;fat;protein

TS201.1

B

1002－0306(2011)04－0306－04

2010－12－17

趙華(1965－)，男，博士，副教授，研究方向:天然產物分離及應用。

國家“863”資助項目(2007AA100404)。