羊棲菜巖藻黃質(zhì)的提取工藝研究

尹尚軍，徐 濤，劉麗平，汪財(cái)生，錢國(guó)英

(浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波315100)

羊棲菜巖藻黃質(zhì)的提取工藝研究

尹尚軍，徐 濤，劉麗平，汪財(cái)生*，錢國(guó)英

(浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波315100)

以真空冷凍干燥羊棲菜為原料，HPLC法檢測(cè)巖藻黃質(zhì)提取率為指標(biāo)，研究了羊棲菜中巖藻黃質(zhì)提取的最佳溶劑及工藝優(yōu)化參數(shù)。結(jié)果表明，羊棲菜中巖藻黃質(zhì)提取的最佳溶劑配比為90%乙醇和丙酮體積比3∶1，液料比40∶1，65℃水浴振蕩提取兩次，每次各80min，得巖藻黃質(zhì)提取率為1.067mg/g(干重)，粗產(chǎn)品得率為1.02%，純度約為13.02%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為巖藻黃質(zhì)色素產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了新的材料來(lái)源與工藝參考。

羊棲菜，巖藻黃質(zhì)，提取工藝

羊棲菜(Sargassum fusiforme)屬于褐藻門馬尾藻科，在我國(guó)主要分布于廣東、福建、浙江等地海域［1］。既能食用又能藥用，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。羊棲菜及其提取物中有多種抗腫瘤和改善人體免疫的活性成分，對(duì)高血壓、大腸癌等均有一定療效［2］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)羊棲菜中多糖、氨基酸和蛋白質(zhì)、軟脂酸等研究報(bào)道較多［3－5］，而其中重要活性物質(zhì)色素類化合物如巖藻黃質(zhì)研究較少。巖藻黃質(zhì)(fucoxanthin，分子式C42H58O6)屬于類胡蘿卜素的一種(見(jiàn)圖1)，廣泛存在于各種藻類、海洋浮游植物、水生貝殼類等動(dòng)植物中［6］，呈黃褐色，從甲醇中得紅棕色晶體，色價(jià)高、抗氧化性強(qiáng)，作為一種功能性天然色素已引起人們廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，巖藻黃質(zhì)具有抗衰老、減肥、抗癌、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)，增加小鼠體內(nèi)的DHA(二十二碳六烯酸)和ARA(花生四烯酸)的含量等功能［7－8］。因此，巖藻黃質(zhì)作為藥物、保健品以及護(hù)膚美容產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)趨勢(shì)在市場(chǎng)上顯而易見(jiàn)。近幾年從海帶干粉中提取工藝研究有少量報(bào)道，但由于其抗氧化作用強(qiáng)，一般加工干燥的海藻體中巖藻黃質(zhì)極容易遭受破壞，提取率方面一直未達(dá)到理想的效果。因此，本文選用冰凍保存的羊棲菜海藻為原料，通過(guò)影響羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取工藝過(guò)程中溫度、時(shí)間、液料比等主要因素優(yōu)化，旨在開(kāi)發(fā)豐富的海洋資源，提高藻類羊棲菜附加值，并為其新型生產(chǎn)途徑及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。

圖1 Fucoxanthin結(jié)構(gòu)式［9］

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羊棲菜 購(gòu)于浙江省溫州洞頭縣5～6月新鮮藻體，清水沖洗表面泥沙、鹽粒，瀝干后于－20℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)前取冰凍藻體于真空冷凍干燥，萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，于－20℃冰箱中避光密封保存?zhèn)溆?巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司，020M1541;甲醇、乙腈 色譜純;其余實(shí)驗(yàn)所需試劑 均為分析純。

Thermo離心濃縮冷凍干燥系統(tǒng) ModulyDD－230 VLP200;UV－3000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá);Agilent－1100型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent;DK－8D型超級(jí)恒溫水浴鍋 上海齊欣;RE52－4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海滬西;FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊棲菜巖藻黃質(zhì)的提取工藝 稱取預(yù)處理羊棲菜粉末，置于具塞三角瓶中，按比例加入提取溶劑，并外包裹錫箔紙后，120r/min恒溫水浴振蕩加熱提取1h，5000r/min離心10min，收集濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中真空濃縮至紅褐色粘稠狀，冷凍干燥成粉末粗品保存。

1.2.2 巖藻黃質(zhì)最大吸收峰的確定及提取溶劑篩選羊棲菜按上述工藝用乙醇溶劑提取上清液稀釋至一定濃度后，與巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液分別于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中350～700nm波長(zhǎng)下掃描，確定巖藻黃質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)。平均稱取等量羊棲菜粉末5份，參考文獻(xiàn)［10］方法改進(jìn)，分別選用不同極性的5種溶劑在相同條件下浸提，將上清液樣品處理后直接用高效液相色譜儀測(cè)定巖藻黃質(zhì)含量，比較提取效果。

1.2.3 提取最佳工藝參數(shù)優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)以巖藻黃質(zhì)提取率為響應(yīng)值，選取影響羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取的溶劑比、提取溫度、時(shí)間、液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并綜合考慮各因素影響后，選取三因素三水平進(jìn)行 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表1)，確定最佳提取工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.4 巖藻黃質(zhì)含量、提取率分析 巖藻黃質(zhì)含量檢測(cè)參考文獻(xiàn)［11］方法改進(jìn)，色譜條件:Hypersil ODS C－18分析色譜柱(Thermo，4.6mm×250mm×5μm)，UWD450nm，柱溫30℃，乙腈/甲醇/0.1%醋酸銨溶液(V/V/V，75∶15∶10)，流速1mL/min。將巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)水乙醇配制成1、4、8、16、32μg/mL系列濃度，Agilent 1100高效液相色譜儀檢測(cè)分析，外標(biāo)法定量。

羊棲菜經(jīng)溶劑提取的上清液定容，過(guò)0.45μm濾膜后上機(jī)分析，求出樣品羊棲菜中巖藻黃質(zhì)含量，并進(jìn)一步計(jì)算羊棲菜中巖藻黃質(zhì)提取率(mg/g)。

巖藻黃質(zhì)提取率(mg/g)=m/M

其中:m－樣品溶液中巖藻黃質(zhì)質(zhì)量(mg);M－樣品液中羊棲菜藻體質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻黃質(zhì)提取液的紫外掃描結(jié)果

按1.2.1方法提取，取上清液于紫外分光光度計(jì)中掃描，同時(shí)與巖藻黃質(zhì)標(biāo)品比較，結(jié)果如圖2所示。掃描曲線發(fā)現(xiàn)，羊棲菜乙醇浸提液及標(biāo)品巖藻黃質(zhì)在可見(jiàn)光波長(zhǎng)450nm左右處均有較強(qiáng)吸收峰，兩樣品與肖策報(bào)道的海帶中提取的巖藻黃質(zhì)掃描圖譜中特征吸收峰基本一致［10］，峰型較寬，表明羊棲菜乙醇粗提取物中主要含有巖藻黃質(zhì)類色素，并在580、630、680nm附近也見(jiàn)較弱的吸收峰，可能含有葉綠素等較多的其它色素［6］。因此，后續(xù)巖藻黃質(zhì)實(shí)驗(yàn)定量選擇波長(zhǎng)450nm，而且粗提液中巖藻黃質(zhì)有待進(jìn)一步分離純化研究。

圖2 巖藻黃質(zhì)提取液紫外－可見(jiàn)掃描圖譜

2.2 高效液相分析巖藻黃質(zhì)含量結(jié)果

根據(jù)1.2.4色譜條件下巖藻黃質(zhì)標(biāo)品系列濃度與樣品上機(jī)分析得色譜圖，如圖3所示，樣品與標(biāo)品中巖藻黃質(zhì)色譜峰均在5.825min有較高的分辨率;以巖藻黃質(zhì)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線得Y=85.17344X－1.67910，R=0.99981，RSD=±4.52%(n=4)，加標(biāo)回收率94.08%(n=4)，表明在此濃度范圍內(nèi)線性較好，巖藻黃質(zhì)色譜峰得到有效分離，樣品檢測(cè)結(jié)果有效。

圖3 巖藻黃質(zhì)標(biāo)品與樣品提取液檢測(cè)色譜圖注:1:4μg/mL巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品;2:樣品。

2.3 提取溶劑的篩選

巖藻黃質(zhì)在中性條件下難溶于水、甲醇等極性較高的溶劑，易溶于酯類和非極性有機(jī)溶劑，為脂溶性色素［10］，因此為了能將羊棲菜中巖藻黃質(zhì)充分提取出來(lái)，實(shí)驗(yàn)稱取5份預(yù)處理過(guò)的羊棲菜各10g，分別選擇用90%乙醇［12］、丙酮、二甲基亞砜、石油醚、二氯甲烷五種不同極性的溶劑，在相同條件下按上述方法分別浸提，濾液經(jīng)過(guò)定容，過(guò)0.45μm濾膜后檢測(cè)，比較巖藻黃質(zhì)提取率。結(jié)果如圖4所示，提取效果最佳的溶劑為乙醇，提取率達(dá)0.915mg/g，其次是丙酮，提取率為0.866mg/g，石油醚效果最差;溶劑篩選結(jié)果與肖策從海帶干粉中提取效果順序無(wú)水乙醇>丙酮>二氯甲烷>石油醚［10］，王文軍等分別用二甲基亞砜和丙酮為提取劑從海帶中提取巖藻黃質(zhì)，丙酮提取率優(yōu)于二甲亞砜結(jié)果一致［13］，表明乙醇及丙酮為羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取的良好溶劑。

2.4 單因素對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率影響

2.4.1 復(fù)合溶劑配比 實(shí)驗(yàn)表明乙醇及丙酮對(duì)巖藻黃質(zhì)都能達(dá)到較好的效果，但考慮丙酮的毒性及對(duì)其它色素如葉綠素類較好的提取效果，因此，選擇了復(fù)合溶劑配比實(shí)驗(yàn)。稱取5g預(yù)處理過(guò)的羊棲菜5份于500mL的三角燒瓶，以液料比為40∶1，分別加入按體積比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的90%乙醇與丙酮為復(fù)合溶劑，于60℃恒溫水浴鍋提取1h。結(jié)果如圖5所示，隨著乙醇所占比例增大，巖藻黃質(zhì)的提取率逐漸增加;當(dāng)二者體積比為3∶1時(shí)達(dá)到峰值，4～5∶1時(shí)提取率有下降趨勢(shì)，即乙醇和丙酮兩者復(fù)合溶劑極性與巖藻黃質(zhì)的極性相近時(shí)，根據(jù)相似相溶原理，同樣條件下巖藻黃質(zhì)提取率達(dá)到最高。實(shí)驗(yàn)表明為減少雜色素的溶出，宜選擇乙醇與丙酮體積比為3∶1提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)為最佳溶劑配比。

圖4 不同溶劑對(duì)羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取的影響

圖5 不同溶劑配比對(duì)羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取的影響

圖6 不同溫度對(duì)羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取的影響

2.4.3 液料比 實(shí)驗(yàn)選擇乙醇與丙酮復(fù)合溶劑與羊棲菜藻體的液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1五個(gè)水平為考察對(duì)象，按照上述方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，比較巖藻黃質(zhì)提取率，結(jié)果如圖7所示。實(shí)驗(yàn)表明隨著液料比的增大，巖藻黃質(zhì)提取率逐漸升高，至液料比超過(guò)50∶1后，巖藻黃質(zhì)提取率增加趨于平緩，而且提取液顏色綠色加深;一定的液料比有助于巖藻黃質(zhì)的提取，但至一定的溶劑量時(shí)巖藻黃質(zhì)已能較完全提取。丙酮常用于提取總色素，故隨溶劑量中丙酮量增加，羊棲菜中葉綠素溶出較多。因此，羊棲菜藻體實(shí)驗(yàn)中巖藻黃質(zhì)的提取液料比應(yīng)考慮50∶1左右為宜。

圖7 不同液料比對(duì)羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取的影響

2.4.4 提取時(shí)間 實(shí)驗(yàn)以30、40、50、60、70min五個(gè)水平提取時(shí)間為考察對(duì)象，按上述方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，巖藻黃質(zhì)提取率逐漸增大，但變化不明顯，超過(guò)60min后增幅減小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王文軍等［13］以濕海帶為原料，二甲基亞砜溶劑提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致，超過(guò)60min后巖藻黃質(zhì)增幅下降;肖策［10］報(bào)道以海帶干粉為原料，乙醇、丙酮、石油醚復(fù)合溶劑提取巖藻黃質(zhì)單因素實(shí)驗(yàn)表明，時(shí)間超過(guò)1.5h后提取液的吸光值增幅下降，因此，說(shuō)明真空冰凍干燥藻體中巖藻黃質(zhì)色素較容易提取，而且省時(shí)省溶劑。

圖8 不同時(shí)間對(duì)羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取的影響

2.4.5 提取次數(shù) 實(shí)驗(yàn)選擇不同提取次數(shù)進(jìn)行羊棲菜藻體中巖藻黃質(zhì)提取單因素實(shí)驗(yàn)，每次提取60min，結(jié)果巖藻黃質(zhì)提取率如圖9所示。當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到2次時(shí)，羊棲菜藻體中巖藻黃質(zhì)的提取率已達(dá)0.988mg/g，加大提取次數(shù)，提取率增幅很小，與肖策［10］提取次數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，從節(jié)約成本考慮，羊棲菜藻體提取巖藻黃質(zhì)宜選擇2次為宜。

圖9 不同次數(shù)對(duì)羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取的影響

2.5 巖藻黃質(zhì)最佳工藝條件確定

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，真空冷凍羊棲菜藻體為原料、90%乙醇∶丙酮(3∶1)、提取2次的條件基礎(chǔ)上，以巖藻黃質(zhì)提取率為指標(biāo)，選取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)3個(gè)因素3水平進(jìn)行L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，各組合實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

表3 方差分析表

正交實(shí)驗(yàn)方差分析表明，從極差結(jié)果得出影響乙醇與丙酮復(fù)合溶劑提取羊棲菜藻體中巖藻黃質(zhì)提取的因素大小依次為RA>RB>RC，即為浸提水浴溫度>提取時(shí)間>液料比。表3方差分析表明，溫度對(duì)復(fù)合溶劑提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率的影響極顯著(P≤0.01);時(shí)間、液料比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率均不顯著。主要原因?yàn)檠驐藵裨弩w經(jīng)冰凍真空干燥后，藻體細(xì)胞容易破裂，巖藻黃質(zhì)較容易被溶出。因此，從表中數(shù)據(jù)可以看出，最佳提取條件為A3B3C2。由于巖藻黃質(zhì)受高溫易異構(gòu)化，綜合考慮工藝條件選擇為A2B3C2，即90%乙醇和丙酮體積比3∶1混合為提取劑，液料比40∶1，65℃水浴加熱提取兩次，每次80min。此條件下驗(yàn)證羊棲菜藻體原料提取巖藻黃質(zhì)提取率達(dá)1.067mg/g(藻體干重約5.65%水分)，粗品得率1.02%，其中粗品中含巖藻黃質(zhì)約13.02%。

3 結(jié)論

從羊棲菜褐藻中提取巖藻黃質(zhì)色素選用乙醇和丙酮溶劑具有較好的效果，并表明巖藻黃質(zhì)為脂溶性色素，易溶于低極性有機(jī)溶劑，少量溶于石油醚，不溶于水。從羊棲菜海藻中提取巖藻黃質(zhì)的最佳工藝:選擇真空冷凍干燥藻體粉(水分約5%左右)，90%乙醇和丙酮體積比3∶1復(fù)合溶劑為提取劑，在液料比40∶1，65℃水浴振蕩提取兩次，每次80min，其提取率HPLC檢測(cè)達(dá)1.067mg/g，高于文獻(xiàn)報(bào)道海帶中提取的巖藻黃質(zhì)的提取率。

實(shí)驗(yàn)為羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取總結(jié)出了較佳的工藝參數(shù)，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。所提取的巖藻黃質(zhì)粗品含有葉綠素和β－胡蘿卜素等其它色素物質(zhì)，應(yīng)進(jìn)一步純化分離，以滿足市場(chǎng)上對(duì)巖藻黃質(zhì)的不同功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用所需純度需求。

［1］季宇彬.海洋湖沼藥物藥理與應(yīng)用［M］.哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，2003:10.

［2］張展，劉建國(guó)，劉吉東.羊棲菜的研究述評(píng)［J］.海洋水產(chǎn)研究，2002，23(3):67－74.

［3］汲晨鋒，吳濤，王翀.羊棲菜多糖分離純化和結(jié)構(gòu)的初步鑒定［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(6):8－12.

［4］陳紹瑗，陳耀祖，莫衛(wèi)民.海洋藥物研究(Ⅱ)－羊棲菜中蛋白質(zhì)和氨基酸分析［J］.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，26(1):45－48.

［5］Lee D Y，Lin X，Paskaleva E E，et al.Palmitic acid is a novel cd4 fusion inhibitor that blocks HIV entry and infection［J］.Research and Human Retroviruses，2009，25(12):1231－1241.

［6］項(xiàng)斌，高建榮.天然色素［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:105－172.

［7］張文竹，劉紅兵，管華詩(shī).裙帶菜的化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展［J］.海洋科學(xué)，2009，33(4):72－75.

［8］Tsukui T，Baba N，Hosokawa M，et al.Enhancement of hepatic docosahexaenoic acid and arachidonic acid contents in C57BL/6J mice by dietary fucoxanthin［J］.Fishery Science，2009，75:261－263.

［9］惠伯棣.類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005:68－322.

［10］肖策.海帶中國(guó)巖藻黃質(zhì)、巖藻甾醇、甘露醇和褐藻糖膠的綜合提取純化工藝研究［D］.西安:西北大學(xué)，2008.

［11］Sugawara T，Baskaran V，Tsuzuki W，et al.Brown algae fucoxanthin is hydrolyzed to fucoxanthinol during absorption by Caco－2 human intestinal cells and mice［J］.Journal of Nutrition，2002，132(5):946－951.

［12］宋云飛.一種從褐藻中提取褐藻素的方法及其應(yīng)用［P］.中國(guó):200710001167.2007－07－18.

［13］Wang W J，Wang G C，Zhang M，et al.Isolation of fucoxanthin from the rhizoid of laminaria japonica aresch［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2005，47(8):1009－1015.

Study on extracting process of fucoxanthin from Sargassum fusiforme

YIN Shang－jun，XU Tao，LIU Li－ping，WANG Cai－sheng*，QIAN Guo－ying
(College of Biological and Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China)

HPLC was used to determine the extraction efficiency of fucoxanthin from vacuum freezing Sargassum fusiforme，and the solvent or process extraction parameter were optimized by determining the extraction efficiency in the present study.The results showed that the optimal procedure was obtained when ratio of 90%ethanol to acetone

(v∶v)was 3∶1，ratio of solvent to dry flower was 40∶1，and horizontal shaking bath was at 65℃ for two times(80min for each time).The extraction efficiency of fucoxanthin，crude product yield and purity were 1.067mg/g(dry weight basis)，1.02%and around 13.02%respectively.The present study provided processing information and new resource for product development of Fucose zeaxanthin pigment.

Sargassum fusiforme;fucoxanthin;extracting process

TS254.1

B

1002－0306(2011)04－0272－04

2010－11－17 *通訊聯(lián)系人

尹尚軍(1968－)，女，副教授，主要從事植物生理生化的研究。

寧波市海洋漁業(yè)局基金甬財(cái)政［2006］603號(hào)/甬海［2006］160號(hào)。