當(dāng)歸藤中總黃酮提取工藝研究

楊瑞云，管海波，張 革，蒙春燕，吳星燕，黃忠京，李 俊

(1.藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西桂林541004;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院，廣西南寧530006;3.廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西桂林541004)

當(dāng)歸藤中總黃酮提取工藝研究

楊瑞云1，管海波1，張 革1，蒙春燕1，吳星燕1，黃忠京2，李 俊3

(1.藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西桂林541004;2.廣西民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)工程學(xué)院，廣西南寧530006;3.廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西桂林541004)

對(duì)當(dāng)歸藤中總黃酮提取工藝進(jìn)行研究。采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，考察了乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)當(dāng)歸藤中總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明，最佳提取工藝為60%乙醇，液料比12∶1，提取3次，每次3h，此工藝條件下總皂苷的提取率為0.28%。

當(dāng)歸藤，總黃酮，正交實(shí)驗(yàn)，提取工藝

當(dāng)歸藤(Embelia parviflora Wall)系紫金牛科酸藤子屬植物，別名小花酸藤子、篩其蔃、大力王，主要分布在廣西、廣東、云南、貴州等地。當(dāng)歸藤味苦、性溫，具有活血散瘀、補(bǔ)腎強(qiáng)腰之功效，常用于治療貧血、跌打損傷、骨折等多種病癥［1］。黃酮類化合物廣泛存在于植物界，在抗菌、消炎、抗突變、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老［2－3］等方面具有很好的效果。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥、食品工業(yè)的快速發(fā)展，黃酮類化合物以其活性高、作用廣泛等特點(diǎn)越來越受到人們的關(guān)注［4］。本課題組在對(duì)當(dāng)歸藤化學(xué)成分的研究中，分離得到了大量黃酮類化合物，而針對(duì)當(dāng)歸藤中總黃酮提取工藝的研究尚未見報(bào)道。本文通過正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，為開發(fā)和利用當(dāng)歸藤中的黃酮類成分提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

當(dāng)歸藤 購自桂林市藥材市場(chǎng);蘆丁對(duì)照品批號(hào)Q8070812，購于成都曼斯特生物科技有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等試劑 均為分析純。

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通儀器有限公司;BS124S型電子天平 賽多利斯(北京)科學(xué)有限公司;R－1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;DZF－1B型真空干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 當(dāng)歸藤總黃酮含量的測(cè)定［3］

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取已干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5mg，置于50mL容量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得0.10mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 測(cè)定波長的選擇 精密量取蘆丁對(duì)照品液

2.0mL于10mL具塞試管中，加80%甲醇溶液至5mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min后，再加入10%硝酸鋁試液0.3mL，搖勻，放置6min，加入1.5mL 10%的氫氧化鈉溶液，加80%甲醇至刻度，搖勻。放置15min后，以不加蘆丁對(duì)照品溶液做參比，于紫外可見分光光度計(jì)400～600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定其測(cè)定波長為500nm。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL具塞試管中，各加入 80%甲醇溶液至 5mL，再加0.3mL5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6min后，加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加10%氫氧化鈉溶液1.5mL，用80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)試劑作空白，15min后在500nm波長處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y=7.1312x+0.0573，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。

1.2.1.4 樣品液的制備和黃酮含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取5g已干燥至恒重的當(dāng)歸藤粗粉，進(jìn)行回流提取，提取液過濾后減壓濃縮，用80%甲醇定容至100mL。精密量取樣品液0.1mL，按1.2.1.3項(xiàng)操作的方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算樣品總黃酮的含量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇濃度的考察 稱取當(dāng)歸藤藥材6份，每份10g，分別以10%、30%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇回流提取，第一次用10倍量的液料比提取2h，第二次提取1h，合并兩次提取液，過濾，濃縮得當(dāng)歸藤提取物浸膏，按照1.2.1.4項(xiàng)操作，測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算總黃酮得率。

1.2.2.2 液料比的考察 稱取當(dāng)歸藤藥材5份，每份10g，分別用液料比為8∶1、10∶1、12∶1、16∶1、20∶1的80%乙醇回流提取2h，過濾，濃縮得浸膏，按照1.2.1.4項(xiàng)操作，測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算總黃酮得率。1.2.2.3 提取時(shí)間的考察 稱取當(dāng)歸藤藥材5份，每份10g，用50mL 80%乙醇回流提取，提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，過濾，濃縮得浸膏，按照1.2.1.4項(xiàng)操作，測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算總黃酮得率。

1.2.2.4 提取次數(shù)的考察 稱取當(dāng)歸藤藥材5份，每份10g，用50mL 80%乙醇回流提取2h，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5次，過濾，濃縮得浸膏，按照1.2.1.4項(xiàng)操作，測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算總黃酮得率。1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，以測(cè)得的提取樣品中總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮提取效果的影響

由圖1可知，在較低乙醇濃度時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率也逐漸增加，但當(dāng)乙醇濃度超過60%時(shí)，總黃酮得率隨乙醇濃度的增加反而減少，可能是隨著乙醇濃度的增大，脂溶性雜質(zhì)增多的原因。因此，選擇乙醇濃度60%左右進(jìn)行考察。

圖1 乙醇濃度對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮提取的影響

2.1.2 液料比對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮提取效果的影響 由圖2可知，隨著液料比增加，總黃酮得率也在不斷增大。但當(dāng)液料比大于12∶1時(shí)，總黃酮得率增加緩慢，即當(dāng)歸藤中黃酮類化合物溶出量已趨向最大值。從環(huán)境保護(hù)和節(jié)約溶劑的角度出發(fā)，選擇液料比12∶1左右作為考察對(duì)象。

圖2 液料比對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮提取的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮提取效果的影響

由圖3可知，提取時(shí)間越長，總黃酮得率越大，當(dāng)提取2.5h后，總黃酮得率增長速度有所減緩。考慮到提取時(shí)間過長，更多的雜質(zhì)被溶出而影響檢測(cè)，選擇2.5h為最佳提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮提取的影響

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮提取效果的影響由圖4可知，隨著提取次數(shù)增加，總黃酮得率也增加。但提取3次后，總黃酮得率變化曲線已較為平緩。考慮到生產(chǎn)工藝對(duì)時(shí)間的要求和溶劑的損耗費(fèi)，提取次數(shù)以3次為宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。根據(jù)表2中的極差R值分析可知，影響當(dāng)歸藤總黃酮提取的主次因素為B>A>C>D，即液料比>乙醇濃度>提取時(shí)間>提取次數(shù)。從表3方差分析可知，B為顯著因素，其它三個(gè)為不顯著因素。綜合以上因素，在所選因素水平范圍內(nèi)，最佳提取參數(shù)組合為A2B3C3D2，即60%乙醇、液料比12∶1、提取時(shí)間3h/次、提取3次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮提取的影響

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 最佳提取工藝條件的驗(yàn)證

按上述最佳提取工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表4。由驗(yàn)證結(jié)果可知，按最佳工藝條件得到的總黃酮含量為0.28%，均高于其他各正交實(shí)驗(yàn)值，RSD=1.32%(n=3)，說明此工藝條件穩(wěn)定、可行。

表3 方差分析結(jié)果

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)當(dāng)歸藤總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳提取條件為60%乙醇、液料比12∶1、每次提取3h、提取3次;當(dāng)歸藤總黃酮提取效果影響最大的是液料比，其次是乙醇濃度和提取時(shí)間，影響最小的是提取次數(shù)。因此，在進(jìn)行當(dāng)歸藤總黃酮的提取時(shí)，必須注意各工藝參數(shù)的調(diào)控。按此工藝重復(fù)驗(yàn)證提取3次，總黃酮得率為0.28%，說明此工藝合理、簡單、穩(wěn)定性好。

［1］陳家源，盧文杰，王雪芬，等.小花酸藤子化學(xué)成分的研究［J］.華西藥學(xué)雜志，1998，13(2):95－96.

［2］馬陶陶，張群林，李俊.中藥總黃酮的含量測(cè)定方法［J］.安徽醫(yī)藥，2007，11(11):1030－1032.

［3］楊瑞云，何瑞杰，李遠(yuǎn)，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選廣豆根中總黃酮的提取工藝［J］.中藥材，2009，32(3):441－443.

［4］王桂玲，房建強(qiáng)，李歡，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選拳參中總黃酮的提取工藝［J］.西北藥學(xué)雜志，2009，24(2):107－109.

Study on the extraction condition of total flavonoids from Embelia parviflora Wall

YANG Rui－yun1，GUAN Hai－bo1，ZHANG Ge1，MENG Chun－yan1，WU Xing－yan1，HUANG Zhong－jing2，LI Jun3
(1.Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medincinal Resources，Ministry of Education of China，School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China;2.School of Chemistry and Ecological Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China;3.School of Environment and Resources Science，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China)

The extraction techniques of the total flavonoids in Embelia parviflora Wall were studied.Orthogonal test was carried out to investigate the effects of concentration of solvent，the radio liquid to material，time length of extraction，and frequency of extraction on extraction results of total flavonoids from Embelia parviflora Wall.The optimum extraction technique was extracted Embelia parviflora Wall in 60%ethanol with the ratio of liquid to material at 12∶1 for 3 times，with 3h for each time.Under these conditions the extraction yield was 0.28%.

Embelia parviflora Wall;total flavonoids;orthogonal test;extraction techniques

TS201.2

B

1002－0306(2011)04－0217－03

2010－03－22

楊瑞云(1978－)，女，博士，副教授，主要從事天然有機(jī)化學(xué)研究。

973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)(2007CB516805);藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金(桂科能0630006－5D08);廣西科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究(桂科基0731050);廣西師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目。