酸土環脂芽孢犴菌檢測與控制技術研究進展

王偉軍，陳麗安，李延華

(1.通化師范學院制藥與食品科學系，吉林通化134002;2.哈爾濱工業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150090)

酸土環脂芽孢犴菌檢測與控制技術研究進展

王偉軍1，2，陳麗安1，*，李延華2

(1.通化師范學院制藥與食品科學系，吉林通化134002;2.哈爾濱工業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150090)

酸土環脂芽孢桿菌是造成果汁變質的一種主要腐敗菌。在生產實踐中快速、準確的檢測手段必不可少，同時對該菌進行控制是提高產品質量、減少污染的重要環節，特別是對其耐熱芽孢的抑制。通過對酸土環脂芽孢桿菌生長、代謝特性的分析，重點闡述了該菌污染的檢測技術和菌種的分離、鑒定方法;同時從果汁生產環節入手探討了控制該菌的各種方法，并指出今后應該進行的研究方向。

酸土環脂芽孢桿菌，檢測，控制

環脂芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus spp.)為非致病性、嗜熱耐酸、嚴格需氧、芽孢形成菌［1－2］。該屬與芽孢桿菌屬的主要區別在于:16S rDNA序列的不同;Alicyclobacillus spp.菌體生物脂膜中存在獨特的環狀脂肪酸，使其具有在低pH和高溫下生存的能力［2］，膜脂中的脂環為六環或七環，位置在ω位。主要脂肪酸有11－環己基十一烷酸、13－環己基十三烷酸、分支十七烷酸(如14－甲基十六烷酸)以及11－環庚基－4－甲基十一烷酸。磷脂酰甘油的脂肪酸相對含量見表1。酸土環脂芽孢桿菌(A.acidoterrestris)是該屬中的一種主要的腐敗菌，可致酸性果汁變質，產生愈創木酚，使產品具有藥味和腐敗味等異味［3］。注:微量脂肪酸略。

表1 磷脂酰甘油的脂肪酸分布［4］

1 污染檢測與菌種鑒定

果汁中A.acidoterrestris腐敗是很難用肉眼檢測的，因為腐敗果汁通常看起來正常，帶有輕微的沉淀，但沒有氣體產生［5］。目前，常見的檢測途徑有:發酵代謝產物和特性分析，如菌體代謝產物的生物圖譜分析;通過鏡檢、菌落觀察、生理生化實驗等手段進行的生長和形態特征分析;以PCR為基礎的分子生物學方法。

1.1 化學檢測

根據該菌種產生異味物質的代謝特點，krueger食品實驗室使用二氯甲烷提取果汁產品中愈創木酚，并進行 GC－MS分析，建立一套嗜熱耐酸菌(ATB)造成果汁愈創木酚污染的檢測方法。圖1是ATB污染果汁(a)與正常果汁(b)的色譜圖比較。

圖1 ATB污染果汁(a)與正常果汁(b)的色譜圖比較

僅憑一種代謝產物為指標判定 A.acidoterrestris菌污染是很難的［6］。這是因為并不是所有的Alicyclobacillus spp.都能產生愈創木酚;而且也存在其他微生物代謝產生愈創木酚的可能。但以一系列代謝產物(一般選擇具有揮發性的風味影響物質)為指標就可能帶來正確的判定。雖然還沒有人依此進行菌種檢測的嘗試，但大量的基礎研究都表明A.acidoterrestris菌 具 有 獨 特 的 風 味 影 響。 在Alicyclobacillus spp.相關腐敗研究中，愈創木酚和鹵代酚(halophenols)被認為是造成異味的成分，雖然形成這些異味成分的確切代謝途徑仍未被確定，但研究認為培養基中Alicyclobacillus spp.的存在是這些異味形 成 的 主 要 原 因［7］。 Siegmund 等［8］認 為A.acidoterrestris是造成蘋果汁異味主要菌種，它們能產生大量異味成分，使在正常存貯條件下的果汁散發出藥味和泥土味。

此外，Alicyclobacillus spp.菌體生物脂膜中存在獨特的環狀脂肪酸可作為一種指示物來完成檢測。眾所周知，以質譜為基礎的多種檢測技術可以較好地完成簡單分子的圖譜分析。Rodrigues等［9］使用GC/MS方法很好地測定了A.acidoterrestris菌菌體細胞膜萃取物(甲酯化)中的ω－環己基十一酸。

但是就復雜分子(如磷脂)而言，通過分析這類化合物(生物圖譜)而確定一種檢測手段較難做到。這種難度不僅在于能否確定和量化目標菌中某一磷脂衍生物分子，如雙磷脂酰甘油(cardiolipin，細胞質膜中主要的陰離子性四酰基磷脂)，同時要考慮到鏈長和不飽和度的差異，而數個酰基鏈上的脂肪酸的組合也會增加這種難度。Rezanka等［10］使用電噴霧質譜(ESI－MS)技術分析了A.acidoterrestris菌體脂質萃取物中的氧酰糖基化雙磷脂酰甘油。圖2為O－酰基甘露糖基雙磷脂酰甘油結構。雖然已經表明這種電噴霧的多級質譜技術適合于雙磷脂酰甘油這類化合物的結構表征研究［11－12］，如脂肪酸取代基的連接位置，但是為了獲得更完全的結構信息，核磁和酶解技術是必不可少的［10］。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)也是常用的檢測技術，其譜帶能反映出這類耐熱菌株間在細胞膜成分上的差異。Lin等［13］分析了波數在1500～800cm－1之間的細胞膜成分(或稱其為“指紋圖譜”)，通過分析不同菌株光譜樣品間的主要成分差異來檢出目標菌。該方法與16S rDNA序列分析方法得出了相同的結果［14］。

圖2 O－酰基甘露糖苷雙磷脂酰甘油

1.2 生物分離與鑒定

1.2.1 基本研究過程 在培養A.acidoterrestris菌時，通常需要熱處理(heat－shock，如80℃，10 min)，這顯然有兩種作用:殺死其他菌體以及促進A.acidoterrestris的芽孢萌發。如果樣品中的目標菌很少，需進行富集，如0.45μm的微孔膜過濾后直接將膜放在酸性(如pH=3.7，也有更低的，如pH=3.5)培養基上培養。通常需要在45～50℃下培養2～5d才能得到菌落。選擇革蘭氏陽性、形成芽孢的菌落進行進一步的分離鑒定。

根據菌體生長和形態特征，也僅知道它們可能屬于環脂芽孢桿菌屬，使用傳統的生理生化反應或生物技術可以進一步鑒定出它們屬于哪個種，如借助UPGMA方法建立起來的 51種表型現象分析［15－16］、快速定性或定量的PCR鑒定技術。最后應該進行發酵實驗，確定它們的污染特性。

1.2.2 培養與分離 酸化PDA、YSG和K氏培養基是目前應用于A.acidoterrestris分離與增殖的最為廣泛的培養基。Murray等［17］考察了6株A.acidoterrestris菌在10種瓊脂培養基上的生長效果，通過研究培養方法(傾注或涂布)、培養溫度(43、50℃)以及培養時間(最多10d)對菌數的影響，認為涂布法優于傾注法;除一株菌之外，其它A.acidoterrestris菌的最適溫度均為50℃;使用不同培養基分別在43℃和50℃下培養后得到了相同的芽孢數，另外，43℃培養3d本質上可以檢測所有的芽孢。

1.2.3 鑒定技術 以PCR技術為基礎建立起來多種快速的菌種鑒定技術。針對耐熱菌的PCR檢測，使用反轉錄(reverse transcriptase，RT)PCR方法可在24h內快速定性檢測［18］，但不能定量。Luo的研究小組［19－20］報道了實時PCR檢測蘋果汁中的耐熱菌，可實現定量檢測;李建科等［21］通過構建耐熱菌競爭模板的引物，用獲得的耐熱菌競爭模板作為定量內標物，建 立 耐 熱 菌 的 競 爭 定 量 (quantitatively competitive，QC)PCR快速檢測方法。

2 控制方法

2.1 采后儲存管理

A.acidoterrestris是一種嗜熱的芽孢形成菌，能夠污染酸性的果汁，在果園里，蘋果可能被這些芽孢污染，從而可能導致其在果汁中生長并造成腐敗，Lee等［22］研究發現氣態的二氧化氯對蘋果表面的A.acidoterrestris菌芽孢具有抑制效果，同時發現高強度處理可以將芽孢數量降到不可檢出的水平，但蘋果感官質量下降;如果低強度長時間處理也能得到很好的抑制效果，而且感官質量無明顯變化。鑒于二氧化氯的效果，可以將其用于蘋果儲存和運輸中對質量的控制，但其使用安全性值得注意。

2.2 果汁殺菌措施

A.acidoterrestris菌生長的溫度范圍是25～60℃。其芽孢能夠生長在pH小于4的環境中，90℃時D值為16～23min［23－24］。K.Savas等［6］研究了pH、溫度以及抗壞血酸濃度對蘋果汁產品中嗜酸耐熱菌芽孢D值的影響，結果表明溫度是最主要的因素，它的影響要比pH的影響大3倍，而抗壞血酸(經常在果汁產品中做添加劑)的影響甚微。此外，培養條件(如果汁酸度或可溶性固形物含量)可以影響芽孢耐熱性，但在傳統的果汁巴氏殺菌后仍能存活［25］。

20世紀90年代以來，傳統(如有機酸和商業消毒劑)和非傳統(如二氧化氯、細菌素、溶菌酶、植物精油)的化學抑菌物質都被用于A.acidoterrestris菌及其芽孢的抑制研究。但是在消費者倡導綠色安全以及食品工業準備逐漸淘汰化學防腐劑的大背景下，天然化合物或者非熱殺菌方法(如高壓、微波和輻照等技術)可以在這個領域大顯身手，本文的論述重點也依此原則展開。

2.2.1 天然植物抑菌劑 使用天然產物控制A.acidoterrestris在酸性食物中的生長已成為共識［26－27］。Bevilacqua等的研究表明，肉桂醛具有很好的抑菌效果［28］，但肉桂醛對產品感官具有很大的影響。因此，可減少的肉桂醛使用量，或與其他手段復合使用［29］;新型抗菌劑的開發應該是未來的研究方向。此外，也可以嘗試使用天然的具有抗菌作用的植物精油(含有多種天然產物)，即使它們的組成成分和作用機制尚不明確。

2.2.2 細菌素 Nisin是提取自乳酸乳球菌乳酸亞種的一種抗菌肽，對革蘭氏陽性菌具有很好的抑制效果，對A.acidoterrestris的細胞和芽孢的抑制也得到了廣泛的證實［30－31］。Walker和 Phillip的研究表明，5～10IU/mL的Nisin單獨使用或者與苯甲酸鈉或山梨酸鉀復配使用對A.acidoterrestris都有顯著的抑制效果［23］。其具體的使用量顯然應該根據果汁類型、酸度以及固形物含量等因素來決定。Nisin可以直接添加到果汁中，也可以使用緩釋技術以控制產品在存儲過程中的腐敗問題［31］。

另外，也應該研究和開發出對A.acidoterrestris營養體和芽孢有抑制作用的其他細菌素。Grande等［32］研究了腸球菌產生的抗菌素(enterocin AS－48)對A.acidoterrestris的抑制作用，在市售果汁中加入2.5μg/mL抗菌素，并接入A.acidoterrestris的營養體或者芽孢，在隨后的37、15、4℃下90d培養中電鏡觀察該菌細胞的變化，發現該菌營養體和芽孢受到了實質性的損壞:細菌被降解，芽孢結構遭到破壞。

2.2.3 物理殺菌 高靜水壓可以使A.acidoterrestris的營養體和芽孢失活，此前的研究表明:通常使用的壓力范圍是200～620MPa;芽孢較營養體有更強的耐受性;殺菌效果受溫度和作用時間的影響;能失活芽孢的壓力(>600MPa)與高溫一樣會帶來產品感官問題。在有關高均質壓的研究中也遇到了相似的問題，雖然二者的作用機理不同:高靜水壓先使芽孢萌發然后滅活，而高均質壓通過破壞細胞壁和生物質膜起作用。

輻射(UV、X和γ射線、電子束等)殺菌的作用機理可能是通過產生自由基破壞細胞DNA來實現的。Nakauma等［33］研究表明，通過與傳統的熱殺菌相結合，能夠得到與高強度熱處理相同的效果，并且能夠有效抑制熱殺菌尾效應(傳統的熱殺菌能快速的殺死芽孢，但隨后未被殺死的芽孢具有很強的耐熱性)。

微波技術已被應用于芽孢的滅活處理。Celandroni等［34］通過與傳統的熱殺菌相比較認為:微波處理會促使芽孢中特有的成分2，6－吡啶二羧酸(DPA)的釋放，而且與熱殺菌造成的芽孢細胞微觀結構損害有明顯差異。Giuliani等［35］將微波技術應用到A.acidoterrestris的滅活實驗表明:微波強度和作用時間是決定因素，并指出針對不同的溶液體系，其殺菌效果可能不同。

2.3 加工過程控制

保持工廠加工環境的清潔衛生是十分必要的。常用消毒劑次氯酸鹽在消除器皿和設備表面對A.acidoterrestris耐熱芽孢的效率不高，而二氧化氯水溶液，如100mg/kg處理10min可以有效殺滅加工環境中耐熱菌芽孢［36］。此外果汁成品除氧密封也是抑制A.acidoterrestris增殖的有效手段。

3 小結

根據生長和形態特征、代謝產物特征以及遺傳特征都可以進行A.acidoterrestris定性檢測。生長和形態特征方法耗時費力，但準確性高，是基礎研究的重要方法;代謝產物方法重點是檢測果汁的污染情況，具有實踐性強、操作方便快捷的特點;遺傳特征方法精度高，但檢測成本昂貴。另外，生長和形態特征分離后結合平板計數的方法以及PCR方法都可以定量檢測。

通過控制A.acidoterrestris的生長，使用復合殺菌手段將是抑制果汁腐敗的有效途徑。使用非傳統的殺菌方法將會受到更多的重視，但具體的應用細節需要做深入研究，例如天然殺菌劑的開發、不同殺菌手段之間的相互作用、溶液體系、食品品質的影響。

［1］Chang S S，Kang D H.Alicyclobacillus spp.in the fruit juice industry:History，characteristics，and current isolation/detection procedures［J］.Critical Reviews in Microbiology，2004，30(2):55－74.

［2］Wisotzkey J D，Jurtshuk P，Fox G E，et al.Comparative sequence analysis on the 16s rRNA DNA ofBacillus acidocaldarius，Bacillus acidoterrestris and Bacillus cycloheptanicus and proposal for creation of new genus Alicyclobacillus［J］.Int J Syst Bacteriol，1992，44:263－269.

［3］Yamazaki K，Okubo T，Inoue N，et al.Randomly amplified polymorphic DNA(RAPD)for rapid identification of the spoilage bacterium Alicyclobacillus acidoterrestris［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1997，61:1016－1018.

［4］Rezanka T，Siristova L，Melzoch K.Identification of(S)－11－cycloheptyl－4－methylundecanoic acid in acylphosphatidylglycerol from Alicyclobacillus acidoterrestris［J］.Chemistry and Physics of Lipids，2009，159:104－113.

［5］Sinigaglia M，Corbo M R，Altieri C，et al.Combined effects of temperature，water activity，and pH on Alicyclobacillus acidoterrestris spores［J］.Journal of Food Protection，2003，66:2216－2221.

［6］Bahceci K S，Acar J.Determination of guaiacol produced by Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice by using HPLC and spectrophotometric methods，and mathematicalmodeling of guaiacol production［J］.Eur Food Res Technol，2007，225:873－878.

［7］Siegmund B，Zierler B P.Growth behavior of off－flavorforming microorganisms in apple juice［J］.J Agric Food Chem，2007，55(16):6692－6699.

［8］Siegmund B，Zierler B P，Fannhauser W.Formation and determination of microbially－derived off－flavour in apple juice［J］.Developments in Food Science，2006，43:277－280.

［9］Rodrigues D C，de Vasconcellos S P，Alves P B.Relationship between cyclohexyl－alkanoic acids and the acidothermophilic bacterium Alicyclobacillus spp.:Evidence from Brazilian oils［J］.Organic Geochemistry，2005，36:1443－1453.

［10］Rezanka T，Siristova L，Melzoch K.Direct ESI－MS analysis of O－acyl glycosylated cardiolipins from the thermophilic bacterium Alicyclobacillusacidoterrestris［J］.Chemistryand Physics of Lipids，2009，161:115－121.

［11］Hsu F F，Turk J.Characterization of cardiolipin as the sodiated ions by positive－ion electrospray ionization with multiple stage quadrupole ion－trap mass spectrometry［J］.J Am Soc Mass Spectrom，2006，17:1146－1157.

［12］Hsu F F，Turk J，RhoadesE R，etal.Structural characterization of cardiolipin by tandem quadrupole and multiple－stage quadrupole ion－trap mass spectrometry with electrospray ionization［J］.J Am Soc Mass Spectrom，2005，16:491－504.

［13］Lin M S，Al－Holy M，Chang S S.Rapid discrimination of Alicyclobacillus strains in apple juice by Fourier transform infrared spectroscopy［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，105:369－376.

［14］Lin M S，Al－Holy M，Al－Qadiri H.Phylogenetic and spectroscopic analysis of Alicyclobacillus isolates by 16SrDNA sequencing and mid－infrared spectroscopy［J］.Sens＆Instrumen Food Qual，2007，1:11－17.

［15］Sahin N.Isolation and characterization of mesophilic，oxalatedegrading Streptomyces from plant rhizosphere and forest soils［J］.Naturwissenschaften，2004，91(10):498－502.

［16］Chen S Q，Tang Q Y，Zhang X D，et al.Isolation and characterization ofthermo－acidophilic endospore－forming bacteria from the concentrated apple juice－ processing environment［J］.Food Microbiology，2006，23:439－445.

［17］Murray M B，Gurtler J B，Ryu J H，et al.Evaluation of direct plating methods to enumerate Alicyclobacillus in beverages［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，115(1):59－69.

［18］Yamazaki K，Teduka H，Inoue N，et al.Specific primers for detection of Alicyclobacillus acidoterrestris by RT－PCR［J］.Letters in Applied Microbiology，1996，23:350－354.

［19］Luo H L，Yousef A E，Wang H H.A real－time polymerase chain reaction－based method for rapid and specific detection of spoilage Alicyclobacillus spp.in apple juice［J］.Letters in Applied Microbiology，2004，39(4):376－382.

［20］Connora C J，Luo H L，Brian B，et al.Development of a real－time PCR－based system targeting the 16S rRNA gene sequence for rapid detection of Alicyclobacillus spp.in juice products［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，99:229－235.

［21］李建科，馮再平，仇農學.耐熱菌的競爭定量PCR檢測方法優化與建立［J］.中國農業科學，2006，39(2):375－380.

［22］Lee S Y，Dancer G I，Chang S S，et al.Efficacy of chlorine dioxide gas against Alicyclobacillus acidoterrestris spores on apple surfaces［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，108(3):364－368.

［23］Walker M，Phillps C A.The effect of preservatives on Alicyclobacillus acidoterrestris and Propionibacterium cyclohexanicum in fruit juice［J］.Food Control，2008，19(10):974－981.

［24］Nakauma M，Saito K，Katayama T，et al.Radiation－heat synergism for inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores in citrus juice［J］.J Food Prot，2004，67(11):2538－2543.

［25］Bevilacqua A，Sinigaglia M，Corbo M R.Alicyclobacillus acidoterrestris:New methods for inhibiting spore germination［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，125:103－110.

［26］Bevilacqua A，Corbo M R，Sinigaglia M.Inhibition of Alicyclobacillus acidoterrestris spores by natural compounds［J］.International Journal of Food Science and Technology，2008，43:1271－1275.

［27］Pena W E，De Massanguer，P R.Microbial modeling of Alicyclobacillus acidoterrestris CRA 7152 growth in orange juice with nisin added［J］.Journal of Food Protection，2006，69:1904－1912.

［28］Bevilacqua A，Corbo M R，Sinigaglia M.Combined effects of pH and cinnamaldehyde in inhibiting Alicyclobacillus acidoterrestris spores［J］.JournalofFood Processing and Preservation，2008，32:839－852.

［29］Bevilacqua A，Corbo M R，Sinigaglia M.Combining eugenol and cinnamaldehyde to control the growth of Alicyclobacillus acidoterrestris［J］.Food Control，2010，21:172－177.

［30］Yamazaki K，Murakami M，Kawai Y，et al.Use of nisin for inhibition of Alicyclobacillus acidoterrestris in acidic drinks［J］.Food Microbiology，2000，17(3):315－320.

［31］BuonocoreG G，SinigagliaM，CorboM R，etal.Antimicrobial release systems from highly swellable polymers［J］.Journal of Food Protection，2004，67:1190－1194.

［32］Grande M J，Lucas R，Abriouel H，et al.Control of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juices by enterocin AS－48［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，104(3):289－297.

［33］Nakauma M，Saito K，Katayama T，et al.Radiation－heat synergism for inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores in citrus juice［J］.Journal of Food Protection，2004，67:2538－2543.

［34］Celandroni F，Longo I，Tosoratti N，et al.Effect of microwave radiation on Bacillus subtilis spores［J］.Journal of Applied Microbiology，2004，94:1220－1227.

［35］Giuliani R，Bevilacqua A，Corbo M R，et al.Use of microwave processing to reduce the initial contamination by alicyclobacillus acidoterrestris in a cream of asparagus and effect of the treatment on the lipid fraction［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，in press.

［36］Friedrich L M，Schneider R G，Parish M E，et al.Mitigation of Alicyclobacillus spp.spores on food contact surfaces with aqueous chlorine dioxide and hypochlorite［J］.Food Microbiology，2009，26:936－941.

Research progress in detection and control of Alicyclobacillus acidoterrestris

WANG Wei－jun1，2，CHEN Li－an1，*，LI Yan－hua2
(1.Department of Pharmercutics and Food Science，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，China;2.Department of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China)

Alicyclobacillus acidoterrestris has been recognized as a significant spoilage organism in fruit juice.It is important part to detect them rapidly and accurately and to control them，especially their heat－resistant spores，for a high quality and less pollution in the juice products.It focused on the detection technologies and the separation and identification methods by analyzing growth and metabolism characteristics of A.acidoterrestris，discussed various control means from the view of juice production chain，and pointed out the direction that future research should be conducted.

Alicyclobacillus acidoterrestris;detection;control

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0437－05

2010－11－27 *通訊聯系人

王偉軍(1979－)，男，博士研究生，講師，研究方向:食品科學。

吉林省教育廳“十一五”科學技術研究項目(2008220);通化師范學院自然科學院級項目(2008027)。