大果少沙棘果渣黃酮對HT29腫瘤細胞活性抑制及DNA損傷作用研究

焦 巖，常 影，王振宇

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾161006;2.齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006;3.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040)

大果少沙棘果渣黃酮對HT29腫瘤細胞活性抑制及DNA損傷作用研究

焦 巖1，2，常 影1，王振宇3，*

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾161006;2.齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006;3.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040)

目的:研究大果沙棘果渣黃酮(Seabuckthorn residue flavonoids，SRF)對人結腸癌HT29細胞生長抑制和DNA損傷的作用。方法:利用MTT比色法測定大果沙棘果渣黃酮對HT29結腸癌細胞生長的抑制率;用單細胞凝膠電泳技術(SCGE)觀察大果沙棘果渣黃酮對HT29細胞DNA的損傷情況。結果:大果沙棘果渣黃酮在濃度20～200mg/L時對結腸癌細胞有明顯的抑制作用，作用72h最大抑制率為81.28%;單細胞凝膠電泳顯示大果沙棘果渣黃酮作用細胞48h后可見明顯的彗星狀拖尾。結論:大果沙棘果渣黃酮可抑制HT29細胞的生長，對其DNA有致損效應。

大果沙棘果渣，黃酮，HT29腫瘤細胞，DNA損傷

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)酸刺屬的灌木或小喬木，主要分布在歐亞大陸東經2°～115°，北緯27°～68.5°的廣大地區，以前蘇聯、蒙古、中國分布最多［1］，我國主要分布在西北、華北、東北及西南等十多個省區，主要有中國沙棘亞種(通常稱為中國沙棘)，還有少量的柳葉沙棘、西藏沙棘、云南沙棘、中亞沙棘等亞種。大果沙棘是從沙棘栽培品種篩選培育出來的果［2］。沙棘中含有豐富的黃酮類物質，研究表明，沙棘黃酮具有清除自由基、抗衰老、抗腫瘤、增強免疫、抗疲勞、改善心腦血管等多項生理功能［3－5］。其中對大果沙棘黃酮對HT29腫瘤細胞生長抑制和DNA損傷的研究還未見報道。本文研究經大孔樹脂純化后的大果沙棘果渣總黃酮對HT29腫瘤細胞生長抑制和DNA損傷的作用，為沙棘黃酮抗腫瘤作用研究和保健食品及抗癌輔助藥品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大果沙棘果渣 黑龍江省孫吳縣林業局提供;大果沙棘總黃酮 首先用超臨界CO2萃取設備將大果沙棘果渣脫脂，然后用75%的乙醇做溶劑，將脫脂后的大果沙棘果渣粉以10∶1液固比進行3次超聲波提取，將提取得到的黃酮液經離心、過濾、濃縮、除去乙醇得到SRF溶液，將SRF溶液用X－5大孔樹脂層析柱進行純化，純化后真空凍干得橙黃色固體粉末，最后用0.5%DMSO溶解，DMEM培養基配制成總黃酮含量分別為20～200mg/L濃度的SRF溶液，進行細胞實驗;人結腸癌細胞株HT29 哈爾濱市腫瘤醫院;DMEM培養基、FBS胎牛血清 美國Hyclone公司;低熔點、正常熔點瓊脂糖、溴化乙錠 上海生工;Triton X－100、MTT sigma公司;其它生化試劑 均為國產分析純。

CO2培養箱 Thermo Forma公司;倒置顯微鏡、熒光顯微鏡 Nikon公司;酶標儀 Biocell公司;100mL培養瓶 美國Promega公司;6孔培養板 德國Greiner;SW－CJ－IF超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;DYY－12型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT比色法測定人結腸癌細胞株的生長抑制率［6］將HT29腫瘤細胞以105個/mL濃度接種于96孔板，每孔100μL，24h后更換培養液，實驗組分別加入20～100μg/mL濃度的SRF溶液，空白對照只加培養液，每組設6個復孔，將培養板置37℃、5%CO2、飽和濕度下分別培養24、48、72h，將培養后的96孔板每孔加入5g/L的MTT 10μL，繼續放入培養箱孵育4h后，小心吸出上清，加入DMSO 150μL/孔，微量振蕩器振蕩5min后，在全自動酶標儀讀取實驗波長570nm，參考波長620nm的吸光值(OD)，計算細胞生長抑制率。

抑制率(%)=(對照組OD值－實驗組OD值)/對照組OD值×100%

1.2.2 普通倒置顯微鏡觀察 將處于對數生長期的HT29腫瘤細胞以105個/mL濃度接種于6孔板，每孔1.0mL，24h后更換培養液，實驗組分別加入50、100、200μg/mL濃度的SRF溶液，空白對照只加培養液，將培養板置37℃、5%CO2、飽和濕度下分別培養48h，后于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 單細胞凝膠電泳實驗［6］

1.2.3.1 制片 取0.5%常溫熔點瓊脂糖溶液，加熱熔化后，冷卻至45℃。取100μL滴于潔凈的載玻片上，立即蓋上蓋玻片，使瓊脂糖均勻地敷在載玻片上，置4℃下10min，待瓊脂糖冷卻變硬，為第一層。取下蓋玻片，分別取經空白對照和經SRF處理后的細胞104個，與75μL 0.5%的瓊脂糖溶液在37℃下混勻，迅速滴在第一層瓊脂糖上，加上蓋玻片，4℃、10min使瓊脂糖硬化。

1.2.3.2 電泳 取下蓋玻片，將玻片立即浸入預冷的裂 解 液 (2.5mol/L NaCl，100mmol/L Na2EDTA，10mmol/L Tris，1%Triton X－100及10%DMSO組成，臨用前配制，pH為10)中，4℃下放置2h。取出玻片，用蒸餾水洗兩次后，放置在水平電泳槽中，加入電泳液(1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH)，液面高出玻片0.25cm，靜置20min，待DNA解螺旋后，以25V 200mA電泳30min。

1.2.3.3 中和與染色 電泳后取出玻片，置于pH7.5、0.4mol/L Tris溶液中洗滌 3次，每次 5min。再以25mg/mL的溴化乙錠(EB)75μL進行染色，加上蓋玻片，盡快觀察結果。以上步驟均在暗室中進行，以防止光線對DNA的損傷。1.2.3.4 結果觀察 觀察EB染色需用熒光顯微鏡，激發波長510～560nm，濾過波長690nm，以400倍拍攝單細胞影像。

拖尾細胞率:每張片子計數100個細胞，記錄拖尾細胞數。

拖尾細胞率(%)=拖尾細胞數/100×100%

拖尾細胞尾長:CASP軟件測量拖尾細胞的總長和頭長。

拖尾細胞尾長(μm)=總長－頭長

1.2.4 數據分析 實驗結果用±s表示，采用SPSS 10.0統計軟件進行方差分析和t檢驗。對每一濃度100個細胞DNA的遷移率進行分析。彗星圖像由casp軟件分析細胞DNA拖尾率和尾長。

2 結果與分析

2.1 SRF對HT29腫瘤細胞生長抑制作用

由表1可見，經20～200μg/mL SRF分別處理HT29腫瘤細胞后，隨著SRF濃度的升高，對腫瘤細胞抑制率逐漸增強。濃度為200μg/mL SRF處理72h后，抑制率最高可達81.28%，呈現明顯的劑量效應關系;在SRF作用細胞24、48、72h后，細胞生長明顯受到抑制，且隨著作用時間的延長，增殖抑制率逐步增高，呈現時間依賴性抑制。

表1 SRF對HT29腫瘤細胞增值抑制作用

2.2 SRF對HT29腫瘤細胞形態的影響

HT29腫瘤細胞經不同濃度的SRF作用48h后，倒置顯微鏡下觀察細胞，由圖1(B、C、D)中可以看出，和對照組相比(圖1A)，細胞數目逐漸減少，細胞間隙增加，細胞變圓、細胞縮小，細胞周圍有數個圓形小體(凋亡小體)圍繞，部分細胞從瓶壁脫落懸浮于培養液中，隨著提取物濃度增大和時間延長，這種變化越來越明顯;而對照組(圖1A)中細胞呈梭形、多角形，生長旺盛，貼壁良好。

2.3 SRF對HT29腫瘤細胞凝膠電泳結果的影響

HT29腫瘤細胞經50、100、200μg/mL SRF作用48h后，可見明顯的彗星狀拖尾，如圖2(F、G、H)，而對照組呈現明亮的圓點，幾乎看不到拖尾現象(圖2E)，說明SRF能夠損傷HT29細胞的DNA。從表2可以看出，和對照組比較，SRF組細胞的DNA損傷細胞率和細胞拖尾長度隨著藥物濃度的升高而增大，且都具有極顯著差異(P＜0.01)。說明不同濃度的SRF對HT29腫瘤細胞DNA有不同程度的損傷，200μg/mL SRF損傷細胞最多，細胞拖尾長度最長。

圖1 不同濃度的SRF對HT29腫瘤細胞形態的影響

圖2 不同濃度SRF對HT29腫瘤細胞凝膠電泳結果的影響

表2 單細胞凝膠電泳檢測SRF對HT29腫瘤細胞的影響(±s，n=100)

表2 單細胞凝膠電泳檢測SRF對HT29腫瘤細胞的影響(±s，n=100)

注:**:P＜0.01，*:P＜0.05，與對照組相比。

組別(μg/mL)DNA損傷細胞率(%)細胞拖尾長度(μm)對照組8.24±1.45 6.2±1.6 50 48.64±4.82** 35.3±5.5**100 87.68±6.74** 63.5±8.2**200 96.41±9.81** 101.2±11.8**

3 討論

沙棘黃酮類化合物具有抗腫瘤功能國內外已有相關報道［7－9］。本研究首先考察了不同濃度大果沙棘果渣黃酮在不同時間內對HT29腫瘤細胞生長抑制作用，MTT法檢測到細胞的凋亡;同時，觀察到了細胞形態上的改變(圖1):細胞變圓、細胞縮小，細胞周圍有數個圓形小體等凋亡的現象，說明了不同濃度SRF對HT29腫瘤細胞具有抑制生長和促進凋亡作用。

單細胞凝膠電泳技術(SCGE)又稱彗星實驗(cometassay)，是近年來發展起來的一種檢測單個哺乳動物細胞DNA斷裂的方法，具有所需樣品量少、快速、靈敏、簡便、適用范圍廣等優點，近年來廣泛用于檢測人和動物各種細胞DNA損傷情況［10］，其原理是動物細胞核DNA損傷的嚴重程度與尾部的長度和熒光強度成正比。因此，測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度可定量單個細胞的損傷程度［11］。從圖2可以看出，未經SRF處理的HT29細胞幾乎沒有或極少產生彗星狀拖尾，隨著藥物濃度的增加，出現彗尾的細胞數越來越多，細胞彗星狀拖尾變長。說明了SRF可能是通過對腫瘤細胞的DNA損傷來抑制腫瘤細胞生長和促使細胞凋亡的。

本研究應用MTT法檢測到SRF對HT29細胞生長有抑制作用，且呈明顯的量效關系;單細胞凝膠電泳檢測到SRF作用于HT29細胞可引起細胞核DNA的損傷，這對SRF抗腫瘤作用和作用機制的研究有重要意義，但細胞凋亡機理和凋亡途徑尚不清楚，需進一步深入研究。

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Inhibition and DNA damage of seabuckthorn residue flavonoids on colon HT29 cancer cells

JIAO Yan1，2，CHANG Ying1，WANG Zhen－yu3，*
(1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;3.Forestry Department，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

Objective:To study the inhibition and DNA damage effects of seabuckthorn residue flavonoids(SRF)on colon HT29 cancer cells.Methods:The inhibition of SRF on human colon HT29 cancer cells was measured with MTT colorimetic method.The DNA damage of HT29 cell was studied in vitro by single cell gel electrophoresis(SCGE).Result:With SRF 20～200mg/L for 72h，the cell inhibition was significant，the optimized inhibition rate was 81.28%.SCGE showed comet－like tails.Conclusion:SRF can inhibit the growth of HT29 cancer cells and damage cells DNA.Key words:seabuckthorn residue;flavonoids;HT29 cancer cells;DNA damage

TS201.4

A

1002－0306(2011)04－0362－03

2009－12－25 *通訊聯系人

焦巖(1981－)，男，博士，研究方向:生物活性物質與功能食品。

黑龍江省重點科技攻關項目(GB06B404－1)。