凍生蝦仁金黃色葡萄菌預測模型的建立用應用

黃馳云，雷曉凌，洪鵬志，黃 和

(廣東省海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088)

凍生蝦仁金黃色葡萄菌預測模型的建立用應用

黃馳云，雷曉凌*，洪鵬志，黃 和

(廣東省海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088)

為得到生蝦仁中金黃色葡萄球菌的生長模型，以期對加工中遭受金黃色葡萄球菌污染后的增長狀況進行預測，通過把金黃色葡萄球菌接種到生蝦仁，按生產工序擬定四個溫度(4、10、13、20℃)并測定該菌在不同溫度下菌落數的變化，采取3種常用方程進行擬合，比較后得出各溫度的最適一級生長模型，并建立二級模型。結果表明，10、20℃適合采用Gompertz模型，13℃為Logistic模型，4℃采用Linear模型;預測表明金黃色葡萄球菌在解凍工序增長較明顯，增長率9.7%;采用平方根方程擬合得到二級預測模型:模型驗證表明預測值和實測值的殘差在±0.01內，偏差因子和準確因子在可接受范圍內，表明模型有效，用于生產預測，具有一定參考價值。

生蝦仁，金黃色葡萄球菌，生長模型，預測微生物

南美白對蝦從上世紀80年代末引進我國，20多年來，我國特別是華南地區的南美白對蝦養殖業已發展成育苗、飼料、養殖、加工、出口的完整產業鏈。但近年來國際市場“綠色壁壘”日益森嚴，許多國家不斷提高對蝦等水產品的準入門檻，我國水產品出口屢次遭遇歐盟和其他國家的技術性貿易壁壘，屢受沉重打擊［1］。金黃色葡萄球菌具有耐熱、耐低溫和耐鹽等特性，是食源性微生物污染的重要細菌。美國在歷年發生的細菌性食物中毒事件中，金黃色葡萄球菌占第一位;在日本、英國和歐洲等一些國家占第二位［2］。我國每年發生金黃色葡萄球菌腸毒素中毒事件也非常多，引起我國衛生防疫和進出口檢驗等部門的廣泛重視［3］，水產品出口中金黃色葡萄球菌是必須檢驗的項目。本實驗擬用生蝦仁為培養介質，采用較節省時間的顯色培養基法進行定量檢測［4］，建立生蝦仁中金黃色葡萄球菌的一級、二級生長動力學模型，并對模型進行驗證，以備將來應用于生蝦仁加工環節的智能化監控，達到降低金黃色葡

表1 各溫度下蝦仁中金黃色葡萄球菌生長模型擬合參數及采用的生長模型

1 材料與方法

1.1 材料與設備

凍生蝦仁 400g，某水產加工出口企業提供;金黃色葡萄球菌菌種 實驗室提供;營養瓊脂 北京陸橋公司;金黃色葡萄球菌顯色培養基 科瑪嘉公司。

生化培養箱SPX－250B型 上海躍進醫療器械廠;西門子電冰箱CD－222型 博西華家用電器有限公司;潔凈工作臺SW－CJ－1F型、手提式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ－SG46－280S型 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備菌懸液及人工染菌 向營養瓊脂斜面中接入金黃色葡萄球菌菌種，37℃培養24h，按同樣方法活化3次后添加生理鹽水，并刮松菌苔振蕩搖勻，梯度稀釋至適當濃度，得到菌懸液［5］。

將蝦仁用無菌蒸餾水沖洗雜質后分裝到4個無菌燒杯中，各100g，將菌懸液緩慢倒入各燒杯中，和蝦仁攪拌均勻，持續20s后倒掉懸液，染菌濃度約102～103cfu/g。用保鮮紙蓋嚴后分別放入4℃冰箱和10、13、20℃培養箱中培養。

1.2.2 分時段菌數計數 每次計數時分別從各燒杯中取10g蝦仁，剪碎后投入盛有90mL無菌生理鹽水的三角瓶充分搖勻，生理鹽水梯度稀釋后，用顯色培養基進行平板計數，37℃培養24h得計數結果。具體為4℃下每24h計數一次;10、13、20℃下每12h計數一次。

1.2.3 建立金黃色葡萄球菌預測模型 用Curve expert軟件，10、13、20℃ 的數據建立 Gompertz、Logistic模型，4℃建立Linear模型。通過比較各模型的標準差S和相關系數R以確定最適擬合方程。

在一級模型的基礎上，對所得到各溫度下的生長速度進行線性擬合，得到金黃色葡萄球菌的二級平方根模型。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌各溫度的一級預測模型

2.1.1 建立10、13、20℃金黃色葡萄球菌生長模型

采用Gompertz、Logistic方程對10、13、20℃下生蝦仁中金黃色葡萄球菌的生長數進行擬合［log(Nt/N0)為因變量，時間t為自變量］，擬合結果見表1。

目前多數學者認為Logistic模型和Gompertz模型的預測效果較好，較廣泛應用于微生物生長模型的擬合［6］。表1各擬合方程的標準差和相關系數顯示，在10、20℃下用Gompertz方程擬合蝦仁中金黃色葡萄球菌一級生長模型較好，在 13℃下則采用Logistic方程較合適。2.1.2 金黃色葡萄球菌在4℃下的失活模型 采用Linear方程，以4℃下蝦仁中金黃色葡萄球菌失活模型［log(Nt/N0)為因變量，時間t為自變量］，得到擬合方程 log(Nt/N0)=－0.0342－0.0024×t，標準差為0.0281，相關系數為0.9788，擬合度高。

圖1～圖4的四種溫度最適模型擬合圖顯示，10℃下金黃色葡萄球菌緩慢生長，36h即已進入穩定期;13℃下，48h內菌數穩定增長，log(Nt/N0)最大值是10℃下的5倍以上，蝦肉中腐敗菌的生長對金黃色葡萄球菌起較強抑制作用，36h后金黃色葡萄球菌增長減慢;20℃下金黃色葡萄球菌在感染蝦仁后的12h內生長較13℃慢，之后迅速增長，由于溫度較高，蝦肉中腐敗菌及其他細菌的強抑制使得48h后金黃色葡萄球菌數開始增速減慢，60h趨于平緩。4℃下，金黃色葡萄球菌數在較長一段時間內緩慢下降，120h后趨于平緩，說明采用4℃環境能抑制蝦肉中金黃色葡萄球菌的增長，但菌體減速緩慢。

圖1 10℃蝦仁中金黃色葡萄球菌的Gompertz生長模型

圖2 13℃蝦仁中金黃色葡萄球菌的Logistic生長模型

2.2 凍生蝦仁加工過程中金黃色葡萄球菌預測模型實際應用

表3 由Gompertz模型和Logistic模型所得的生長參數(

表3 由Gompertz模型和Logistic模型所得的生長參數(

溫度(℃) 模型方程umax 10 log(Nt/N0)=0.2169×e－e1.2762－0.1221×t 0.0987 13 log(Nt/N0)=1.2398/(1+18.5998×e－0.1361×t) 0.1565 20 log(Nt/N0)=1.4894×e－e1.9224－0.0981×t 0.2318

圖4 4℃蝦仁中金黃色葡萄球菌的Linear失活模型

2.2.1 凍生蝦仁的主要加工工序 出口凍生蝦仁每步加工工序蝦肉溫度均不相同，經對加工過程實地考察并記錄平均溫度和工序時間，將其中溫度較高，持續時間較長的工序定為關鍵控制工序，并納入模型的建立和預測，其他工序時間短或轉換快，影響忽略不計。圖5為關鍵工序及相應的溫度和持續時間。

圖5 凍生蝦仁關鍵工序的溫度及持續時間

2.2.2 凍生蝦仁加工過程中金黃色葡萄球菌增長水平預測 通過所得預測模型可以查出在生產過程中的關鍵控制點［7］。采用所得到的模擬方程進行菌數水平預測。假定生蝦仁中金黃色葡萄球菌初始值為10cfu/g，按四步關鍵工序預測每步工序菌數的變化。

表2所示，解凍工序金黃色葡萄球菌數的增長率最高，為9.7%，剝殼和泡藥時間對菌數影響較小，冰存條件下菌數減少5.2%。該結果表明解凍過程中金黃色葡萄球菌易大量生長，是整個流程的關鍵控制點，冰存能較好抑制菌數增長。

2.3 凍生蝦仁中金黃色葡萄球菌的二級預測模型

2.3.1 溫度－生長速率二級預測模型的構建 采用平方根模型建立二級模型，其形式為:Tmin)，b為系數，Tmin為理論最低生長溫度，即回歸線延長線與溫度軸相交所得的溫度。在4℃下生蝦仁中金黃色葡萄球菌數目呈遞減趨勢，一級模型為存活模型而非生長模型，因而平方根二級模型采用10、13、20℃的最大比生長速率(umax·h－1)的平方根。通過線性回歸，得出回歸方程umax=0.0129T－0.0220，Tmin=1.71℃，相關系數R2=0.9886，結果如表3和圖6所示。

平方根模型得到的最低生長溫度為1.71℃。微生物在極端條件下的生長速率一般難以確定，在不同介質環境生長速率也不同［8－9］。在4℃下金黃色葡萄球菌數逐步下降，與1.71℃較接近，該最低生長溫度仍有一定參考意義，平方根模型具有較好的適用性。圖6中10～20℃范圍里，金黃色葡萄球菌的生長速率與溫度具有良好的線性關系，擬合度較高。

圖6 生蝦仁中金黃色葡萄球菌二級模型

2.3.2 溫度－生長速率二級預測模型的驗證 采用殘差法驗證二級預測模型。表4為不同溫度下金黃色葡萄球菌生長速率的觀測值和預測值，預測值減觀測值為殘差。所有的殘差值均在－0.01與0.01之間，殘差大小與預測值的順序無關，預測模型在ɑ=0.01水平可信［10］。

表4 金黃色葡萄球菌二級預測模型驗證分析

引入偏差性因子和準確性因子對預測值和觀測值分析，因子公式見表5。模型的可接受條件為偏差因子在0.75和1.25之間［11］。準確性因子衡量預測值與實測值的平均誤差，越接近1則表明兩者吻合，準確度高。該因子在1.1～1.9之間均可接受。通過計算得到模型的偏差性因子和準確性因子均符合模型可接受條件的要求，該模型可較好反映生蝦仁中金黃色葡萄球菌在不同溫度下生長速率的快慢情況。

表5 金黃色葡萄球菌二級模型偏差性、準確性分析

3 結論

本研究得到生蝦仁中金黃色葡萄球菌在四個不同加工環節的一級預測模型，以及描述溫度和生長速率關系的二級模型。從運用模型預測金黃色葡萄球菌在實際加工工序的增長狀況看，假定蝦體解凍前初始金黃色葡萄球菌數為10cfu/g，經過四步關鍵工序后增長至10.63cfu/g，增長6.3%。四步工序中，解凍工序溫度較高，菌落增加最快，因此該工序應避免粗放式解凍，對其解凍溫度進行跟蹤，且盡可能做到解凍松塊后即進入剝殼工序，減少金黃色葡萄球菌快速增長的機會。盡管剝殼工序中菌數增長較少，但人手頻繁接觸蝦體，且有相關報道凍蝦仁生產車間的部分工作臺、多數作業手套污染較為嚴重［12］，因此半成品感染的可能性不能忽視，工作服、手套需嚴格按規定進行嚴格消毒，盡可能降低剝殼過程感染金黃色葡萄球菌的幾率。冰存工序中低溫保存對金黃色葡萄球菌有一定的抑制能力，可通過調整工序時間，如增加工人加快批量剝殼速度以換取較長的冰存時間，減少金黃色葡萄球菌風險，提高產品食用安全性。

本研究以生蝦仁作培養基質，成分復雜，菌相非單一，把菌間可能存在的相互促進或抑制作用納入作為考慮因素，一定程度上提高了模型預測的可靠性。

溫度是影響微生物生長的主導因素［13］，金黃色葡萄球菌的生長除受溫度影響外，還受其他環境因素的影響。Bunchana等曾在建立金黃色葡萄球菌的溫度、pH、NaCl、NO2的單因素模型基礎上得到多因素響應面模型，T.P.Oscar等研究低初始菌數和高初始菌數對模型的影響［14］，但增加參數同時也增加建模難度及模型的復雜度，不利于應用［15］。在凍生蝦仁加工出口企業實際生產過程中，溫度是最容易進行實時監督和給予及時調控的重要參數，通過建立金黃色葡萄球菌在凍生蝦仁的一級預測模型和溫度－生長速率二級預測模型進行安全評價符合生產實際，且操作簡單，預測及時，節約大量時間和費用［16］，為建立安全預警機制和風險評估體系提供理論依據［17］。

［1］康俊生.水產品出口歐盟的技術法規標準及其對策研究［J］.上海標準化，2004(9):58－62.

［2］王麗哲，晉懷峰，宮樹權，等.金黃色葡萄球菌污染水產品的研究［J］.食品科學，2001，22(5):78－81.

［3］陳彬，黃曉蓉，湯敏英，等.蝦仁制品中金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢測研究［J］.疾病監測，2006，21(6):302－304.

［4］Silva BO，Caraviello DZ，Rodrigues AC，et al.Evaluation of Petrifilm for the Isolation of Staphylococcus aureus from Milk Samples［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(8):3000－3008.

［5］姜英杰，鄒曉葵，彭增起.大腸桿菌在豬背最長肌上生長預測模型的建立［J］.食品科學，2008，29(12):115－119.

［6］郭全友，楊憲時.冷藏大黃魚不同細菌生長模型的比較［J］.南方水產，2005，5(1):44－49.

［7］Maarten J Nauta，John B Dufrenne.Variability in Growth Characteristics of Different E.coli O157∶H7 Isolates，and its Implications for Predictive Microbiology ［J］.Quantitative Microbiology，1999，1:137－155.

［8］Donald W Thayer，Wayne S Muller，Robert L Buchanan.Effect of NaCl，pH，Temperature，and Atmosphere on Growth of Salmonella typhimurium in Glucose－Mineral Salts［J］.Medium Applied and Environmental Microbiology，1987，6:1311－1315.

［9］肖琳琳，張鳳英，楊憲時，等.預報微生物學及其在食品貨架期預測領域的研究進展［J］.海洋漁業，2005，27(1):68－73.

［10］傅鵬，馬昕，周康，等.熱死環絲菌生長預測模型的建立［J］.食品科學，2007，28(9):433－437.

［11］MilesDW，RossT，OlleyJ，etal.Developmentand Evaluation of a Predictive Model for the Effect of Temperature and Water Activity on the Growth Rate of Vibrio parahaemolyticus［J］.Int J Food Microbiol，1997，38:133－142.

［12］雷曉凌，曾少葵，蔣志紅，等.某出口凍蝦加工廠生產過程中的微生物檢測［J］.中國食品衛生雜志，2005，17(1):27－29.

［13］T P Oscar.Predictive models for growth of Salmonella typhimurium DT104 from low and high initial density on ground chicken with a natural microflora［J］.Food Microbiology，2007，24:640－651.

［14］李柏林，郭劍飛，歐杰.預測微生物學數學建模的方法構建［J］.食品科學，2004，25(11):52－57.

［15］Hiroshi Fujikawa，Akemi Kai，Satoshi Morozumi.A New Logistic Model for Escherichia coli Growth at Constant and Dynamic Temperatures［J］.Food Microbiol，2004，21:501－509.

［16］王璐華，寧喜斌.副溶血性弧菌生長預測模型的建立與應用探討［J］.華北農學報，2008，23(增刊):63－67.

［17］Walls I，Scott VN.Use of Predictive Microbiology in Microbial Food Safety Risk Assessment［J］.International Journal of Food Microbiol，1997，36:97－102.

Establishment and application of predictive growth model of Staphylococcus aureus in the frozen fresh shelled shrimp

HUANG Chi－yun，LEI Xiao－ling*，HONG Peng－zhi，HUANG He
(Food Science and Technology College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

This paper was aimed to establish the growth model of Staphylococcus aureus in the frozen shelled shrimp，in order to predict the growth of Staphylococcus aureus in the shrimps during processing.Inoculations of Staphylococcus aureus to the frozen shelled shrimps were carried out.According to the actual situation of the process，four different temperatures(4，10，13，20℃)were selected to determine the Staphylococcus aureus growth in frozen shelled shrimp.Two kinds of equations were used to fit the data which result in the optimum primary growth models after comparison，thus established the secondary growth model.The fitting results showed that Gompertz equation was best for 10℃ and 20℃ growth model，Logistic equation was best for 13℃ growth model，Linear equation was adopted for 4℃.Predictions in processing by models indicated that obvious growth of Staphylococcus aureus could be found in the processes of unfreezing，the growth rate were 9.7%.The square root equation was adopted to get the secondary predictive model:Model validation showed that the residual errors of predicted value and measured value were within±0.01，factors of deviation and accuracy were in acceptable range.The model possessed good dependability that can be useful for microbe prediction in processing.

fresh shelled shrimp;Staphylococcus aureus;growth model;predictive microorganism

TS254.1

A

1002－0306(2011)04－0081－04

2010－01－21 *通訊聯系人

黃馳云(1984－)，男，碩士研究生，主要從事水產品安全的研究。

國家科技部支撐計劃項目(2006BAK02A22)。