清半夏炮制過程中化學物質及刺激性變化研究

黃永亮，范靈婧，王雙雙，孫靈根，吳純潔

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb．)Breit．的干燥塊莖。具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結之功效［1］。其主要成分有生物堿、谷甾醇葡萄糖苷、胡蘿卜苷、草酸鈣、半夏蛋白、氨基酸、有機酸、無機元素、半夏胰蛋白酶抑制物、膽堿等［2］。

生半夏毒性較強，臨床上一般炮制后使用。將半夏礬制成清半夏可達到降低毒性的目的，即將生半夏經8%白礬溶液浸泡至“口嘗微有麻舌感”。本文通過對清半夏炮制過程中物質基礎及刺激性變化研究，揭示半夏礬制對其各種化學成分的影響，同時積極探討以生物評價法代替口嘗法確定炮制終點，從而達到保護工作人員，控制批次間穩定性的目的。

1 實驗材料

紫外－可見分光光度計(TU－1091，北京普析通用儀器公司)，氨基酸自動分析儀(835－50型，日本日立公司)。

生半夏(購于四川省新荷花飲片有限公司，經成都中醫藥大學李敏教授鑒定)，10日齡SPF級雞胚(購于溫江正大畜禽有限公司)，臺盼藍(購于上海歐韋達儀器科技有限公司)，磷酸生理鹽水溶液(自制)，甲酰胺、白礬、鹽酸、氫氧化鈉(購于成都科龍儀器化工有限公司)，所用試劑均為分析純，水為去離子水。

2 實驗方法

2.1 供試樣品的制備

清半夏的炮制:取大小一致的半夏，室溫條件下用8%白礬溶液浸泡，分別于規定時間點取樣適量，濾去白礬溶液，60℃烘干，粉碎，過篩，備用。

生半夏及其炮制品混懸液的制備:稱取一定量半夏粉末(過200目篩)，加水研磨，分別制成200 mg·50 mL－1、100 mg·50 mL－1濃度的混懸液。

2.2 雞胚尿囊膜試驗［3］

配制含系列濃度臺盼藍的甲酰胺溶液(5×10－7mol·L－1，4×10－7mol·L－1，2.5×10－7mol·L－1，1×10－7mol·L－1，6×10－8mol·L－1)，在 595 nm 波長下測定其吸光度，以吸光度值(A)對臺盼藍的量(X/×10－7mol)作標準曲線。

取10日齡SPF級雞胚，用手電筒照射確定雞胚氣室并沿氣室邊緣劃出其范圍，剝去蛋殼，暴露蛋殼膜，加2～4滴水于蛋殼膜上，小心剝去蛋殼膜，暴露尿囊膜(CAM)。肉眼觀察CAM的完整性及有無出血點等變化，如有出血點或CAM破損則剔除，不能用于下一步試驗。試驗時，先加入適當量磷酸生理鹽水(PBS)以緩沖其滲透壓，在CAM上放一硅膠環以固定接觸面積，將0.3 mL半夏混懸液加入硅膠環內，作用2 min，然后用約20 mL生理鹽水輕柔沖洗至CAM表面干凈。5 min后，用0.4 mL的0.1%的臺盼藍通過硅膠環作用于CAM 1 min，過量的染料用蒸餾水漂洗至澄清。精確分離環面積內已染色的CAM，用3 mL甲酰胺提取臺盼藍，放置1 h。用紫外－可見分光光度計于595 nm波長下測定其吸光度，并對應標準曲線計算臺盼藍的量。

以不同等級的國際標準刺激物:15%十二烷基磺酸鈉(強刺激性)、二甲亞砜(中度刺激性)、丙二醇(弱刺激性)為陽性對照;未處理的CAM的吸收值為空白對照;PBS為溶劑對照。

2.3 氨基酸含量測定

按照中華人民共和國國家標準GB/T18246－2000，采用酸水解法中的常規水解法進行實驗測定，檢測環境溫度:24℃。

2.4 有機酸含量測定

取不同炮制程度的清半夏粉末約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，同上操作，再重復提取2次，放冷，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣精密加入氫氧化鈉滴定液(0.1 mol·L－1)10 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，轉移至50 mL量瓶中，加新沸過的冷水至刻度，搖勻，精密量取25 mL，按照電位滴定法測定，用鹽酸滴定液(0.1 mol·L－1)滴定，并將滴定的結果用空白試驗校正。每1 mL氫氧化鈉滴定液相當于5.904 mg的琥珀酸(C4H6O4)。

2.5 白礬殘留量測定

取不同炮制程度清半夏粉末(過四號篩)約5 g，精密稱定，置坩堝中，緩緩熾熱，至完全碳化時，逐漸升高溫度至450℃，灰化4 h，取出，放冷，在坩堝中小心加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用熱水5 mL沖洗，洗液并入坩堝中，濾過，用水50 mL分次洗滌坩堝及濾渣，合并濾液及洗液，加0.025%甲基紅乙醇溶液1滴，滴加氨試液至溶液顯微黃色。加醋酸－醋酸銨緩沖液(pH 6.0)20 mL，精密加乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05 mol·L－1)滴定至溶液自黃色轉變為紅色，并將滴定液的結果用空白試驗校正。每1 mL的乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05 mol·L－1)相當于23.72 mg的含水硫酸鋁鉀［KAl(SO4)2·12H2O］。

3 實驗結果

3.1 雞胚尿囊膜染色試驗

3.1.1 臺盼藍吸收標準曲線

以吸光度值(A)對臺盼藍的量(X/×10－7mol)進行線性回歸，得標準曲線方程:A=0.0676X+0.0034(R2=0.995)。證明經甲酰胺溶解的臺盼藍在595 nm處的吸光度與臺盼藍的量具有很好的線性關系。

3.1.2 雞胚尿囊膜試驗評價生半夏及其炮制品的刺激性

試驗以國際標準刺激化學物質為陽性對照，另設空白對照，評價生半夏及炮制品的刺激性。

三批雞胚尿囊膜染色試驗結果見表1，刺激性變化趨勢圖見圖1。

試驗結果表明濃度為100 mg·50 mL－1的半夏生品混懸液有明顯的刺激性，其細胞損傷強度與15%十二烷基磺酸鈉(SDS)相當。而清半夏刺激性較生半夏以及國際標準刺激物質中的強刺激性物質15%SDS、中度刺激性物質二甲亞砜弱，但其刺激性強于弱刺激性物質丙二醇。

聚類分析將清半夏炮制過程0～72 h的樣品刺激性聚類分析成三類，結果顯示0～16 h半夏具有強刺激性作用，聚類中心為12.38;24～40 h半夏刺激性降低，為中度刺激性，聚類中心為10.28;48～72 h半夏刺激性顯著降低，為弱刺激性，聚類中心為4.51。

表1 五批清半夏不同炮制時間刺激性

圖1 清半夏炮制過程中刺激性變化趨勢

3.2 不同炮制時間樣品氨基酸含量

分別選取炮制時間為0 h、24 h、32 h和48 h的半夏炮制品，按氨基酸測定法測定17種氨基酸的含量，并得到氨基酸含量變化趨勢，結果見表2，變化趨勢見圖2。

表2 不同炮制時間清半夏各種氨基酸含量

圖2 炮制時間對清半夏氨基酸含量的影響

由分析結果可以看出，生半夏總氨基酸含量為4.16%，在清半夏炮制過程中，各種氨基酸含量的變化趨勢相似，都是先升高后降低。

3.3 不同炮制時間樣品有機酸含量

表3 不同炮制時間清半夏琥珀酸含量

圖3 清半夏琥珀酸含量隨炮制時間變化趨勢

分別選取不同炮制時間的清半夏樣品，按有機酸測定方法測定樣品中有機酸的含量，含總酸以琥珀酸計，結果見表3，其含量變化趨勢見圖3。

3.4 不同炮制時間樣品白礬含量

分別取不同炮制時間清半夏粉末5 g，精密稱定，按照白礬限量測定方法測定，并作出白礬含量隨炮制時間變化趨勢圖。隨著炮制時間增加，清半夏中白礬含量逐漸升高。結果見表4，圖4。

表4 不同炮制時間清半夏白礬含量

圖4 不同炮制時間清半夏白礬含量變化

4 結論與討論

清半夏的炮制，藥典要求浸泡至“口嘗微有麻舌感”，以達到降低毒性，減小刺激性的目的。實驗證明白礬溶液浸泡能逐漸降低半夏的刺激性，口嘗結果表明，浸泡48 h以后可以達到藥典規定程度。傳統的經驗評價用口嘗法來判定炮制終點，帶有很大的主觀性，雞胚尿囊膜染色試驗能客觀表征半夏的刺激性強度，通過分析可以確定“口嘗微有麻舌感”對應的刺激性強度范圍，若將此方法應用于炮制生產，建立生物評價法判定炮制終點，將有望取代傳統的人工口嘗，提高標準的客觀性，保證產品穩定，在生產上有很好的應用前景。

半夏富含17種氨基酸，生半夏中總氨基酸含量為4.16%。氨基酸是半夏的藥效物質之一，對評價半夏的質量有重要的參考價值。該實驗結果表明，在清半夏炮制過程中，各種氨基酸的含量變化趨勢均為先升高后降低。為了減少氨基酸類成分的損失，應控制半夏炮制時間，不可為追求減毒而盲目延長炮制時間。

2010年版藥典規定生半夏按干燥品計算，含總酸以琥珀酸計，不得少于0.25%。清半夏含總酸以琥珀酸計，不得少于0.30%。本實驗結果表明，半夏炮制過程中有機酸含量呈緩慢下降趨勢，炮制48 h樣品的有機酸含量為0.35%，與文獻報道［4］白礬溶液能增加有機酸含量的結論不一致。由于半夏炮制過程變化復雜而緩慢，應采取多批次測定，以揭示其含量變化的真正規律。

白礬中的鋁離子對人體有害，2010年版藥典規定了清半夏中白礬限量為10%。由于隨著炮制時間延長，白礬含量呈上升趨勢，所以應控制合適的炮制時間，以減少清半夏中鋁離子的含量，保證用藥安全。

［1］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010:110．

［2］ 杜貴友，方文賢．有毒中藥現代研究與合理應用［M］．北京:中國中醫藥出版社，2000:413．

［3］ 張小琳，吳純潔，黃永亮．中藥半夏的刺激性評價－雞胚尿囊膜試驗［J］．中國科技論文在線，2010:03．

［4］ 張琳，吳皓，朱濤，等．多指標正交試驗優化清半夏炮制工藝［J］．中成藥，2008，30(5):704．