HPLC 法測定頭花蓼中槲皮素與山奈酚的含量

李雨生，王祥培，萬德光，吳紅梅

頭花蓼為蓼科植物頭花蓼(Polygonum capitatum Buch．—Han．ex D．Don)的干燥全草或地上部分，主產于貴州、云南、四川、西藏、廣西等省區。我國民族地區常將頭花蓼用于治療泌尿系統感染、血尿、濕疹、腎盂腎炎、膀胱炎、尿路結石、風濕痛、跌打損傷、痄鰓、瘡瘍、腹瀉和痢疾等［1－2］。其中黃酮類成分為其主要成分［3－4］。目前文獻報道［5－8］測定了不同產地頭花蓼中總黃酮、沒食子酸、槲皮苷、槲皮素的含量，但同時測定不同產地野生與栽培頭花蓼中槲皮素與山奈酚的含量未見報道。本實驗采用高效液相色譜法同時測定12批頭花蓼中槲皮素與山奈酚的含量，方法靈敏，數據穩定，可為評價不同產地野生與栽培頭花蓼質量提供參考。

1 儀器與材料

日本島津LC－10AT高效液相色譜儀，SPD－10A紫外檢測器，浙大智達N2000色譜工作站，SB2200型超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司)。

槲皮素(批號081－90003)、山奈酚(批號0861－200002)對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，水為重蒸鎦水。頭花蓼藥材:共12批樣品，分別產自貴州、四川、云南、西藏等地，均由貴陽中醫學院王祥培副教授教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Alltima C18(5 μm，4.6 mm×250 mm);柱溫:室溫;流動相為:甲醇－0.4%磷酸(50∶50);流速:0.8 mL·min－1;檢測波長:360 nm。理論塔板數按槲皮素、山奈酚計算應不低于4000，在上述色譜條件下，對照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.2 線性關系的考察

精密稱取槲皮素對照品10.8 mg、山奈酚對照品5.1 mg，各加甲醇溶解定容至100 mL，作為貯備溶液。精密吸取槲皮素貯備液10 mL、山奈酚貯備液5 mL混合，加甲醇定容至50 mL，搖勻，即得混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液 1、3、6、9、12、15、18 μL，依次進樣，以進樣量(μg)為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標進行回歸分析，得槲皮素回歸方程為:Y=1E+06x－1779.8，r=0.9998，線性范圍為 0.0216 μg ～ 0.389 μg。山奈酚為:Y=2E+06x+1758.1，r=0.9993，線性范圍 0.0051 μg ～0.0918 μg。

2.3 水解時間的考察

取西藏墨脫產頭花蓼粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流提取(分別進行0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h 的時間考察)，放冷，稱重，用提取液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。按2.1項下色譜條件，分別進樣對照品與供試品溶液10 μL測定峰面積，并計算其含量，數據結果見表1。

表1 酸水解時間考察結果(n=3)

2.4 供試品溶液制備

取頭花蓼細粉0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流1.0 h，放冷，稱重，用提取液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.5 精密度試驗

吸取對照品溶液10 μL，連續進樣5次，記錄色譜圖，結果槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.96%、1.27%。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在 0、1、2、4、8、12 h 進樣，記錄色譜圖，結果槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為1.45%、1.26%。表明供試品溶液在0～12 h內穩定性良好。

圖1 頭花蓼的HPLC色譜圖

2.7 重復性試驗

取同批藥材5份，精密稱定，按2.3項下供試品溶液制備方法制備并測定，槲皮素平均含量為0.529%，RSD為1.12%;山奈酚平均含量為0.033%，RSD為1.95%。

2.8 回收率試驗

取已知含量頭花蓼粉末6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別添加濃度為 0.108、0.051 mg·mL－1槲皮素、山奈酚對照品溶液10 mL、2 mL，按2.3項下供試品溶液制備方法制備并測定，計算，槲皮素、山奈酚的平均回收率分別為97.37%、97.09%，其RSD分別為1.19%、1.88%，表明該方法回收率較好。結果見表2、表3。

表2 槲皮素回收率試驗結果

表3 山奈酚回收率試驗結果

2.9 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液與12批頭花蓼藥材供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件測定，并計算槲皮素、山奈酚的含量。結果見表4。

表4 不同地區頭花蓼中槲皮素與山奈酚含量(n=3)

3 討論

2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》只規定了頭花蓼藥材中槲皮素含量。本研究同時進行了槲皮素與山奈酚的含量測定，在上述色譜條件下，待測成分與相鄰峰達到基線分離，且回收率高，重復性好，為更好地控制頭花蓼藥材及其制劑的內在質量提供了依據。在檢測樣品的制備方法上，比較了加熱回流0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h，結果1 h 以上，黃酮苷水解基本完全，鹽酸的濃度不宜再高，酸性太強對儀器和色譜柱腐蝕作用大。

根據實驗的數據結果可知，產于貴州盤縣的野生頭花蓼中槲皮素、山奈酚含量較高，貴州施秉栽培的頭花蓼較四川成都栽培頭花蓼的槲皮素、山奈酚含量高，但所收集的12批樣品中槲皮素的含量均大于0.1%，均符合2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》的規定，可為頭花蓼資源的開發、利用提供數據參考依據。

致謝

西藏墨脫縣墨脫鎮人民政府王祥森同志提供西藏樣品。

［1］ 全國中草藥匯編編寫組．全國中草藥匯編(下冊)［M］．北京:人民出版社，1978:282．

［2］ 江蘇新醫學院編．中藥大詞典(上冊)［M］．上海:上海人民出版社，1977:611．

［3］ 李勇軍，駱宏豐，王永林，等．頭花蓼黃酮類化學成分的研究［J］．中國藥學雜志，2000，35(5):300．

［4］ 萬德光．中藥品質研究—理論、方法與實踐［M］．上海:上海科學技術出版社，2008:333．

［5］ 王祥培，萬德光，王祥森，等．不同產地野生與栽培頭花蓼中總黃酮的含量分析［J］．時珍國醫國藥，2006，17(9):1713．

［6］ 楊立勇，王祥培，吳紅梅，等．HPLC測定不同產地的頭花蓼中槲皮苷的含量［J］．貴陽中醫學院學報，2009，31(4):67．

［7］ 王祥培，萬德光，王強，等．HPLC測定不同產地的頭花蓼中沒食子酸的含量［J］．華西藥學雜志，2007，22(2):204．

［8］ 吳紅梅，賀祝英，王祥森，等．高效液相色譜法測定頭花蓼中沒食子酸與槲皮苷的含量［J］．時珍國醫國藥，2009，20(1):18．