中江石泉丹參叢枝菌根真菌鑒定

朱毓霞，宋杰，肖文娟

菌根(mycorrhiza)是自然界中一種普遍的植物共 生現象，它是一類土壤真菌與植物根系形成的一種互惠共生體［1］。Harley(1989)根據參與共生的真菌和植物種類及它們形成共生體系的特點，將菌根分為7種類型，即泡囊－叢枝菌根(VAM)、外生菌根(ECM)、內外生菌根(EM)、漿果鵑菌根(ARM)、水晶蘭類菌根(MM)、歐石蘭類菌根(ERM)和蘭科菌根(OM)［2］。其中分布最為廣泛，與農林牧業生產關系最為密切的是泡囊－叢枝菌根(VAM)，簡稱叢枝菌根(AM)。許多研究表明，AM真菌可以促進植物根系對磷、銅、鋅等礦質元素的吸收，提高植株對水分脅迫的抗性，增加植物激素的合成和分配，從而能全面改善宿主植物的生長狀況;AM真菌在穩固土壤的團粒結構，改善土壤質量等方面也有突出作用;同時，AM真菌對自然界中植物之間碳的遷移，維持寄主植物的多樣性和植物資源分布，維持生態系統的功能和穩定性也有重要意義［3］。

丹參Salvia miltiorrhiza Bunge為唇形科植物。關于丹參的叢枝菌根真菌，目前國內尚未見相關報道。本試驗以中江石泉栽培丹參為研究對象，對丹參根系是否有叢枝菌根真菌的侵染、侵染情況、叢枝菌根真菌的種類等方面進行研究，以便通過接種叢枝菌根真菌來提高丹參的產量和質量。

1 實驗材料

丹參根系及根際土壤(采自四川中江石泉)、FAA固定液(70%酒精 90 mL，冰乙酸 5 mL，福爾馬林5 mL)、酸性品紅乳酸甘油染色液(乳酸87.5 mL，甘油6.3 mL，蒸餾水6.3 mL，品紅0.094 g)、棉蘭試劑(苯酚10 g，乳酸10 mL，甘油20 mL，水溶性苯胺藍0.02 g，蒸餾水10 mL)、Melzer’s試劑(碘 1.5 g，碘化鉀5 g，蒸餾水100 mL)、PVLG試劑(聚乙烯醇8.33 g，蒸餾水50 mL，乳酸50 mL，甘油5 mL)。

2 實驗方法

2.1 樣品的采集及預處理

S型采樣，選取25株丹參作為取樣點，每個取樣點間隔2 m，去掉表層2 cm厚的表土，采集距地表2～30 cm土層中丹參的根系與根際土壤。剪取丹參藥材須根，輕輕洗凈泥沙，用純凈吸水紙吸干水分，選擇直徑小于2 cm的須根100～200條，裝入三角瓶內，用FAA液固定。將采集的丹參根際土壤置通風陰涼處風干，裝入大信封內封好，并在袋內袋外貼上標簽，注明編號、地點、海拔、地形、采樣人、采樣時間等。

2.2 丹參根系叢枝菌根真菌侵染率測定

用堿解離－乳酸甘油酸性品紅染色法對根樣進行染色處理［4］。

(1)組織透化:將經FAA液固定的根系取出，剪成0.5～1 cm的小段，放入試管中，加入5～10%KOH溶液，90℃水浴解離40 min，對根段進行透明處理;

(2)漂洗:將KOH溶液倒掉，待試管冷卻后用清水沖洗根段2～3次;

(3)酸化:用KOH溶液處理后，根的堿性很強，必須將其酸化，才有利于乳酸甘油酸性品紅試劑對叢枝菌根結構的良好染色。在試管中加入2%HCl溶液，對根段進行酸化，以促進染色，5 min后將HCl倒掉;

(4)染色:在試管中加入適量乳酸甘油－酸性品紅染色液，90℃水浴解離40 min(可回收染色液重復利用);

(5)鏡檢:將染色后的根系加入注有乳酸的培養皿中脫色，用鑷子挑取15條粗細一致的根段整齊地排列在干凈載玻片上，加蓋玻片后于光學顯微鏡下觀察并記錄根樣中有無叢枝菌根真菌的侵染及侵染情況(植物細胞不著色，真菌組織染成紅色)。處理200條根段，按根段頻率標準法測定菌根侵染率，即沒有菌根結構的根段其侵染率為0%，整條根段全被侵染的為100%，只有一半長度的根段被侵染的為50%，以此類推，并記錄各侵染率下的根段條數。侵染率計算公式如下:

侵染率(%)={∑(0%×根段數+10%×根段數+20%×根段數+……+100%×根段數)}÷觀察總根段數

2.3 叢枝菌根真菌孢子的分離和鑒定

2.3.1 叢枝菌根真菌孢子的分離

采用濕篩傾注－蔗糖離心法［5］從根際土樣中分離叢枝菌根真菌孢子。具體操作為:稱取100 g土樣，倒入大燒杯中，加入500 mL水，浸泡30 min，用玻棒充分攪勻，靜置10 s后，將上層的土壤懸浮液慢慢地倒入最上一層土壤篩內(最好集中在一小范圍內傾倒，以保證篩出的孢子盡量集中，減少損失)過篩，20/80/150/300/400目(上篩20目，底篩400目)，反復洗土并過篩3～4次，用水反復沖洗各篩面的篩出物，直至沒有土壤微粒為止。然后用清潔的洗瓶將80/150/300/400目篩面的孢子及雜物分別沖入大離心管內加水定容，經3000 rpm/min離心3min，去掉上懸液，加入50%蔗糖定容，搖勻管底沉淀物，1500 rpm/min離心1.5min，取出離心管將上懸液馬上過400目篩，用清潔的洗瓶將各篩面上滯留的篩出物輕輕地洗入潔凈的培養皿內。

2.3.2 AMF孢子的鑒定

采用形態特征分類鑒定法［6～7］。具體操作如下:將濕篩得到的孢子置體視鏡下觀察，按孢子的大小、形態、顏色等進行初步分類。然后，用微吸管或挑針挑取孢子置于載玻片上，加浮載劑PVLG，在顯微鏡下觀察孢子的顏色、形狀、測量孢子大小，連孢菌絲的有無及著生方式，附屬結構等，然后將孢子調整至最佳位置，壓破孢子用油鏡測量孢壁總厚度，連點形狀及寬度和連孢菌絲寬度，從蓋玻片一側加入乳酸，重測上述數據。觀察孢壁結構，發芽方式等特征;孢壁顏色、分層分組情況、各壁層的質地類型，內含物的性質等。鑒定中輔助使用Melzer’s試劑、棉藍酚試劑，觀察孢子的特異反應，對有代表性或特異性的特征隨時拍照。綜合以上觀察結果，參照檢索表(Schenck＆Perez，1988 AM菌根真菌鑒定手冊)和近幾年發表的新種、新記錄種，同時參照國際AM菌種保藏中心(International Culture Collection Center of Vesicular and Arbscular Mycorrhizal Fungi)在internet上(http://invam．caf．wvu．edu)提供的種的描述、圖片及相應分類單元的原始發表進行AMF種的鑒定，鑒定到屬和種。

3 結果與分析

3.1 丹參根系叢枝菌根真菌的侵染率

通過染色試驗發現，所采丹參根系樣品有菌根侵染，且全部屬于AM類型。AMF侵染宿主丹參的根系并形成典型的AM。AMF菌絲在宿主根系外蔓延生長，形成外生菌絲并產生根外孢子;同時，菌絲在宿主皮層細胞間延伸生長，形成內生菌絲，并分支進入細胞內發育成叢枝結構，在細胞內和細胞間形成多種形狀的泡囊。結果證明，丹參確有AM存在，侵染率為17.6%，侵染強度不高。丹參根系叢枝菌根真菌侵染情況見圖1。

圖1 丹參根系叢枝菌根真菌侵染

3.2 丹參叢枝菌根真菌種的鑒定

從丹參根際土壤中共分離出13種AM真菌，其中球囊霉屬(Glomus)9種，占已鑒定屬種的69.23%，是丹參根系重要的AMF菌種群。無梗囊霉屬(Acaulospora)3種，占23.83%，盾巨孢囊霉屬(Scutellspora)1種，占7.94%，鑒定到種的有8種，分別是Glomus caledonium、Glomus clarum、Glomus constrictum、Glomus geosporum、Glomus mosseae、Glomus sinuosum、Acaulospora scobiculata、Acaulospora lacunosa。其中有5份孢子只鑒定到屬而未鑒定到種，這些孢子或因缺乏明顯的分類特征，或未見有相關描述而難于做種的鑒定。叢枝菌根孢子形態見圖2。

圖2 叢枝菌根孢子形態

4 討論

丹參能被叢枝菌根真菌侵染，形成典型的菌根結構，故丹參也是一類菌根營養型植物;已分離鑒定出丹參AMF13種，隸屬3個屬，包括球囊霉屬、無梗囊霉屬和盾巨孢囊屬。其中，球囊霉屬9種，是丹參AM真菌中最大的種群。

本試驗采用丹參人工栽培區樣品。由于其獨特的生態環境易誘發各種病蟲害，如根腐病、葉斑病、根結線蟲病、斜紋夜蛾、蠐螬、地老虎等，所以在栽培過程中使用了大量農藥，造成有害物質在土壤中大量殘留［8］。這對AMF的侵染、種類組成等有很大的影響。所以試驗結果未能完整反映出丹參AMF的組成，仍需進一步的研究。

［1］ 楊顯志，邵華，周成，等．叢枝菌根研究及應用［J］．云南農業科技，2001，4:38．

［2］ 劉潤進，陳應龍．菌根學［M］．北京:科學出版社，2007．

［3］ 王賢波．叢枝菌根(AM)的研究進展及展望［J］．杭州農業科技，2007，2:19．

［4］ M．Brundrett，L．Melville，L．Peterson．Practical methods in mycorrhiza research［M］．Mycolo gue Publications，1994．

［5］ Gerdemann JW，Nicolson YJ．Spore of mycorrhizal Endo gone species extracted from soil by wet sieving and decantation［J］．Trasactions of British Mycolo gical Society，1963，46:235．

［6］ Morton JB，Benny GL．Revised classification of arbuscular mycorrhizal fungi(zy gomycetes):a new order，Glomales，two new suborders，Glomineae and G gasporineae and two new families，Acaulosporaceae and Gi gasporadeae，with an emendation of Glomaneae［J］．Mycotaxon，1990，37:471．

［7］ Berch SM．Endo goaceae taxonomy specificity fossile reccord phylo geny［J］．Frontiers of Applied Microbiolo gy，1987，2:161．

［8］ 張美慶，王幼珊．環境因子和AM真菌分布的關系［J］．菌物系統，1999，18(1):25．