釀酒酵母ADH2基因沉默表達載體的構建

林燕環，魏 芳，葉冰瑩，張積森，陳由強

(福建師范大學生命科學學院/農業部甘蔗遺傳改良重點開放實驗室，福建 福州 350108)

可再生生物能源能夠替代不可再生能源，支持可持續發展的能源，具有重大現實意義。目前隨著能源危機的加劇，在產業規模方面發展最快的是燃料乙醇[1]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是乙醇發酵的主要菌種[2]。因此獲得乙醇高產菌株是其發展方向。在釀酒酵母中與乙醇代謝相關的乙醇脫氫酶由ADH1－ADH5編碼，其中ADH2催化乙醇氧化為乙醛，其他4個編碼基因催化乙醛還原成乙醇[3－5]。在發酵培養過程中，當葡萄糖被消耗完后，ADH2開始催化利用乙醇作為碳源[6]。因此，破壞ADH2催化的乙醇分解代謝反應，提高釀酒酵母合成乙醇的能力是可行的。目前主要利用基因敲除技術敲除ADH2基因，一些研究表明ADH2基因敲除突變株遺傳穩定性差[2]。本文利用重疊延伸PCR方法，構建了釀酒酵母ADH2基因沉默的表達載體，以期獲得高產的乙醇突變株并能克服遺傳穩定差的缺點。

1 材料與方法

1.1 菌種及質粒載體

工業釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大腸桿菌DH5α由福建師范大學生命科學學院農業部甘蔗生理遺傳開放重點實驗室提供。pUG6和表達載體pYES2.0由福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心惠贈。

1.2 酶和主要試劑

高保真酶、rTaq酶、T4DNA連接酶、KpnⅠ和NotⅠ均購于Takara公司。凝膠純化試劑盒購自Promega公司。PCR引物由上海生工公司合成。DNA測序由TAKARA公司完成。

1.3 引物設計

根據重疊延伸PCR的原理設計引物[7]，合成以下2對引物。(1)P1:5'-CGGGGTACCAGCTACAAAAAGCATACAATCAACT-3'，P2:5'-GCGTACGAAGCTTCAGCTGGCCCTTAACGTTTTCACCCATGCCG-3';(2)F1:5'-CAGCTGAAGCTTCGTACGC-3'，F2:5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3'。

其中P1引物為5'UTR序列前25個堿基，且在5'端引入KpnⅠ的酶切位點;P2引物中5'端前19個堿基與Kanr基因序列前19個堿基互補;F1引物為Kanr基因序列前19個堿基;F2引物與Kanr基因序列3'端23個堿基互補，并在5'端引入NotⅠ酶切位點及保護堿基。

1.4 重疊延伸PCR擴增沉默組件

該沉默組建需要3個PCR反應來完成。首先以釀酒酵母Y01基因組為模板，P1、P2為上下游引物，進行PCR擴增ADH2基因的5'UTR(PCR1)，同時以質粒PUG6為模板，F1、F2為上下游引物，進行PCR擴增KanMX(PCR2)。PCR1、PCR2的反應用高保真酶，按標準方法以50 μL體系進行擴增，將 PCR1、PCR2的產物按照膠回收試劑盒推薦方法進行純化回收。然后取PCR1的純化產物1 μL，PCR2的純化產物0.4 μL為模板，以P1、F2為上下游引物，進行第3個PCR(PCR3)。通過第3個PCR，用外側引物將 片段5'UTR和KanMX完成拼接。具體的擴增程序參照表1。

表1 PCR反應條件Table1 PCR reaction conditions

1.5 重組表達質粒的構建

通過KpnⅠ、NotⅠ分別將空表達載體pYES2.0和插入片段雙酶切，連接獲得表達質粒，構建圖1。

圖1 釀酒酵母表達載體pSADH2構建示意圖Fig.1 Construction of the silencing expression vector

1.6 ADH2基因沉默表達載體pSADH2的構建與鑒定

將上述PCR3擴增得到的重疊延伸PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。將鑒定為正確的片段膠回收純化后，用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切，回收約1942 bp的片段，與經KpnⅠ和NotⅠ雙酶切純化的表達載體pYES2.0過夜連接;將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板。挑取白色菌落，37℃ 200 r·min－1搖菌過夜，提取質粒，進一步用酶切和測序鑒定。陽性重組質粒命名為pSADH2。

2 結果

2.1 PCR

分別用引物P1、P2和F1、F2進行PCR擴增獲得ADH2基因的5'UTR基因和KanMX基因。然后，以這2個片段為模板，以P1、F2為引物重疊延伸PCR獲得融合片段。電泳結果(圖2)表明，PCR擴增出5'UTR基因、KanMX基因及其融合片段與預期的理論值大小相符，可用于后續的研究。

2.2 ADH2基因沉默表達載體pSADH2的鑒定

新構建的沉默表達載體pSADH2共7797 bp，以pYES2.0為載體，帶有沉默ADH2基因以及G418的抗生素標記基因，可以用G418來篩選培養轉化菌株。

提取構建的沉默表達載體pSADH2質粒DNA，根據其多克隆位點進行酶切鑒定，用限制性內切酶KpnⅠ和NotⅠ分別對其單酶切和雙酶切，酶切產物電泳結果見圖3。

圖2 PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR product

圖3 pSADH2質粒DNA酶切產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis pattern of the plasmid pSADH2 digested by restriction digestion

2.3 ADH2基因沉默表達載體pSADH2的序列測序鑒定

提取構建的沉默表達載體pSADH2質粒DNA測序結果(圖4)與pUG6上KanMX基因與ADH2的5'UTR序列完全相符。通過以上結果分析，構建的ADH2沉默表達載體pSADH2結構正確，可用于后續的轉化試驗。

3 討論

本研究采用重疊延伸PCR成功構建了釀酒酵母ADH2基因沉默表達載體。重疊延伸PCR技術已被廣泛應用，不僅可以應用于擴增長片段基因、定點突變和基因敲除等，而且在定點突變上的應用具有突變效率高、操作簡單、成本低等優點[8]，但仍存在一些需要解決的問題。由于延伸獲得的片段是經PCR擴增產生的，因此拼接的準確性一定程度上受PCR反應保真度的影響，并且該技術操作過程中很大一部分靠經驗的指導，并沒有標準的操作條件，對擴增未知序列仍然有一定的困難。

圖4 測序結果Fig.4 The result of sequence

pYES2.0質粒是釀酒酵母穿梭載體，自身帶有GAL1啟動子、URA3和Amp抗性標記基因便于篩選。pYES2.0質粒屬于非整合型載體，插入片段需帶有啟始編碼子和終止子，含有多個克隆位點便于外源片段的插入，目前廣泛運用于釀酒酵母內重組蛋白的表達。經酶切及序列分析可知，本研究已成功構建了釀酒酵母ADH2基因沉默表達載體pSADH2，可以進一步進行轉化釀酒酵母及表達量的研究。

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