化療藥對結直腸癌細胞株SW1116中DCC基因影響的實驗研究

王旭東,姜洪偉,張 偉,王海珠,朱寶平,陳 明,梁國棟,徐 華

(1.吉林大學第二臨床醫院普通外科,吉林長春130041;2.內蒙古自治區醫院腫瘤科;3.長春中醫藥大學附屬醫院)

結直腸癌是我國較常見的嚴重危害人民健康的惡性腫瘤之一,世界范圍的流行病學調查資料表明,在各類惡性腫瘤中,結直腸癌的發病率占第3位,僅次于胃癌和肺癌的第三位惡性腫瘤,結直腸癌已成為危害人們身體健康的嚴重疾病。腫瘤發生、發展是多基因、多階段的過程,癌基因的激活與抑癌基因的失活及異常被認為是腫瘤的發生的重要的分子機制。結直腸癌治療方式主要是手術治療,術前化療,放療可使腫瘤縮小,術后化療,放療可預防腫瘤復發和轉移,而化療藥如何使抑癌基因發揮抑癌效應是目前研究熱點[1],本文就常用化療藥(順鉑和5氟尿嘧啶)對結直腸癌細胞株SW1116DCC基因影響加以闡述。

1 材料與方法

1.1 標本 SW1116細胞株購自中科院上海生物研究所。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent(Invitrogen公司)。Taq DNA聚合酶,dNTP,DL2000 DNA Marke,AMV Reverse Transcriptase,Low Protein Marker(均購自寶生物工程有限公司)。RNase抑制劑;丙烯酰胺;N,N'-亞甲雙丙烯酰胺;N,N,N,N'-四甲基乙二胺;十二烷基硫酸鈉(SDS);四甲基乙二胺(TEMED)均購自Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞的化療藥處理方法 取對數生長期的SW1116細胞,計數,調細胞濃度5×105,加入6孔板,分別加入 3.0 μ g/ml的 DDP,260 μ M 的 5-Fu。作用6 h、12 h、24 h后,提取細胞的mRNA和蛋白備用。

1.3.2 化療藥對DCC基因的影響 引物的設計與合成:嚴格按照引物設計原則。本研究所用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。上游引物:5′-AAGCTTCCGCCACCATGACAGTCTTGGTTCCGCCATG-3′,下游引物:5′-CTCTCTCTCGAGCTAACTGGAGCTTGGGATAGCAGGC-3′。

我們采用RT-PCR法研究常用化療藥對DCC基因轉錄的影響,采用Western-Blot法化療藥對DCC蛋白表達的影響。

2 結果

2.1 RT-PCR法檢測 DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的轉錄影響見圖1。從圖1可以看出,以RT-PCR法雜交出的特異性條帶的灰度值高低來判斷不同化療藥物作用不同時間對結直腸癌細胞株SW1116中DCC基因轉錄的影響。順鉑和5-氟尿嘧啶可以促進DCC基因轉錄的表達,6小時開始上升,12小時表達量最高,隨著時間的增加,DCC基因的轉錄開始下降,細胞生長明顯減慢,24小時達低值。

圖1 RT-PCR法檢測 DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的轉錄

2.2 DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的蛋白影響 見圖2。從圖2可以看出:western blot雜交出的特異性條帶的灰度值高低來判斷不同化療藥物作用不同時間對結直腸癌細胞株SW1116中DCC蛋白表達的影響。順鉑和5-氟尿嘧啶作用結直腸癌細胞株SW1116,可以促進DCC蛋白的表達,并且在6小時DCC蛋白表達開始上升,12小時更加明顯,表達量最高,細胞生長明顯減慢,24小時達低值。結果表明DCC基因表達水平降低或缺失在結直腸癌的發生發展及轉移過程中可能起了重要的作用,尤其對大腸癌細胞轉移浸潤過程的影響更為明顯,說明常用化療藥物可通過使癌細胞表達DCC量的上升來實現其抗癌作用。

圖2 Western-Blot法檢測DDP、5-Fu處理的SW1116中DCC基因的蛋白表達

3 討論

DCC基因定位于人染色體18q21.3,全長300-400 kb,至少含有28個外顯子,cDNA長約4 341 bp。Cho等從基因庫里分離出含所有已知編碼序列的噬菌體,克隆其完整全長1.4 Mb,確定了第29號外顯子的存在,并確定了每個內外顯子的邊界序列。DCC基因的表達蛋白是Ⅰ型跨膜糖蛋白,由1447個氨基酸組成,相對分子質量為190 KD,該蛋白主要包括3個功能區,即胞外區、跨膜區和胞內區,該膜糖蛋白在許多研究中被指出與細胞分化有關。該基因為腫瘤抑制基因[2]。該基因的最重要的功能已經在神經系統中被描述為netrin-1的受體。結腸癌缺失基因敲出的小鼠證實了這個基因在腫瘤轉移方面的一個很重要的角色,然而質疑了該基因在腫瘤抑制的意義和作為黏液受體方面的不同。結腸癌缺失基因轉染HT-29人結腸細胞會增加細胞之間的黏附性,損害細胞之間的物質交換,細胞和細胞之間以及細胞和基質之間黏附結構在不同組織之間細胞正常結構的保持和發展有關的遷移起著重要作用,以及組織重構和病理狀態,連接復合體連接著細胞外基質的配體和鄰近細胞為骨架提供細胞表面的化學信號提供分子支持。在人體上,細胞外骨架蛋白細胞外基質和鄰近細胞連接起來,特別是在信號傳導中。一個大的黏附蛋白家族包含著免疫球蛋白,以各種各樣的免疫球蛋白和纖維蛋白III的出現為特征。發現與神經系統發育中的軸突導向有關,并且是細胞凋亡的誘導因子之一。這些基因編碼細胞內轉換子,作用于TGF-β配體家族成員的信號轉導途徑[3]。

5-FU對腫瘤殺傷作用的強弱,直接與抑制胸苷酸合成酶的程度有關,亦即決定于三元復合物的穩定性。順鉑的活性受溶液中的氯離子的影響極大,在生理鹽水中其活性在24小時以上是穩定的,但是在不含氯離子的溶液中,其活性每小時減少10%[4]。順鉑在體液條件下,由于體液的氯離子濃度高,它大部分以原型化合物的形式存在,但是當其進入低氯離子濃度的細胞內,其氯基被代謝。代謝產物荷正電,它具有類似于烷化劑雙功能基團的作用,與細胞內的親核基團結合,主要與DNA鏈上的堿基作用,與堿基結合形成三種形式的交聯,改變其作為正常復制模板的功能,造成DNA的損傷,破壞DNA的復制,誘導細胞的凋亡,阻斷細胞周期的G2期,它還可以間接促進機體免疫而產生細胞毒作用[5]。

本實驗研究表明:采用RT-PCR法和western blot法雜交出的特異性條帶的灰度值高低來判斷不同化療藥物作用不同時間對結直腸癌細胞株SW1116中DCC基因的影響。從基因轉錄水平和蛋白水平觀察:順鉑和 5-氟尿嘧啶作用結直腸癌細胞株SW1116,可以促進DCC基因的轉錄和蛋白表達,并且在6小時DCC蛋白開始上調,12小時更加明顯,表達量最高,細胞生長明顯減慢,24小時達低值。結果表明DCC基因表達水平降低或缺失在結直腸癌的發生發展及轉移過程中可能起了重要的作用,尤其對大腸癌細胞轉移浸潤過程的影響更為明顯,說明常用化療藥物可通過使癌細胞表達DCC量的上升來實現其抗癌作用。成為大腸癌基因治療的一個有效靶基因。

[1]Kim TH,Lee H K,Seo IA,et al.Netrin induces down regulation of its receptor,Deleted in Colorectal Cancer,through the ubiquitin proteasome pathway in the embryonic cortical neuron[J].J Neurochem JT Journal of neurochemistry,2005,95(1):1.

[2]龍陳艷,唐衛中.DCC基因與結直腸癌的研究進展[J].結直腸肛門外科,2009,15(6):431.

[3]Sarah Derks,Linda J.W.Bosch et al.Promoter CpG island hyper methylation and H3K9me3 and H3K27me3-mediated epigenetic silencing targets the deleted in colon cancer(DCC)gene in colorectal carcinogenesis without affecting neighboring genes on chromosomal region 18q21[J].Carcinogenesis,2009,30(6)1041.

[4]Andoh T,Chargaff E.Formation and fate of abnormal ribosomes of E.Coli cells treated with 5-fiuorouracil[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,54(4):1181.

[5]Selvakumaran M,Pisareik DA,Bao R.Enhanced cisplatin cytotoxicity by-Disturbing the nucleotide excision repair pathway in ovarian cancer cell lines[J].Cancer Res,2003,63(6):1311.