膽囊腺癌pAKT、VEGF、微血管和微淋巴生成的檢測及其臨床意義

王甘露,姜漢國,黃 婷,賀 德,侍立志,陳 暉

(1.深圳市寶安區人民醫院 外一科,廣東深圳518101;2.廣東醫學院病理教研室,廣東湛江524023)

近二十多年分子生物學的研究表明腫瘤的發生發展與腫瘤細胞的跨膜信息傳遞機制密切相關。目前,許多學者發現PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶)信號傳導通路異常改變與人類一些惡性腫瘤發生發展密切相關[1-5]。膽囊腺癌是較少見的一類惡性腫瘤,多見于60歲以上的女性,早期診斷困難;一旦臨床確診,絕大多數已發生浸潤和轉移,預后差。有關膽囊腺癌轉移的機制目前尚不清楚,為探索PI3K/AKT信號傳導通路異常是否與其發生發展相關,本研究應用免疫組化法檢測臨床46例膽囊腺癌組織中pAKT、VEGF的表達及其微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(MLD),旨在探討它們對膽囊腺癌發生發展的影響。

1 資料與方法

1.1 標本來源 選取復旦大學附屬中山醫院和廣東醫學院附屬醫院2003年1月至2008年12月資料完整的46例膽囊腺癌根治術標本,患者術前均未經過任何抗腫瘤治療。46例中男11例,女35例,中位年齡62歲;有淋巴結轉移17例,無淋巴結轉移29例。另選取膽囊腺瘤和慢性膽囊炎各10例作為對照組。全部標本經10%中性甲醛液固定,石蠟包埋,5 μ m厚連續切片待測。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常規HE染色,膽囊腺癌分別按WHO分型及有無淋巴結轉移進行分組。

1.2.2 免疫組織化學染色 免疫組化按SP試劑盒說明書步驟操作。由試劑公司提供的乳腺癌pAKT和VEGF陽性切片為陽性對照,PBS代替1抗作為空白對照。抗CD34、CD31和D2-40單克隆抗體及免疫組織化學試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司,pAKT(S473)和VEGF多克隆抗體購自Cell Signaling公司。分別應用抗血管內皮CD31和CD34單克隆抗體雙標和D2-40單克隆抗體來檢測膽囊腺癌組織中的MVD和MLD。

1.3 結果判斷 pAKT、VEGF、CD34、CD31 和 D2-40定位于細胞質,細胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性細胞＞10%為陽性表達。MVD和MLD按文獻[6,7]計數,即在低倍鏡下選擇癌灶周圍間質血管密集區,用400×高倍視野內計數4個不同區域的微血管和微淋巴管,取其平均值為微血管和微淋巴管密度。

1.4 統計學方法 實驗數據統計采用統計學軟件SPSS13.0。根據資料類型和統計目的不同分別做四格表 χ2檢驗,Spearman相關分析,獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 pAKT和VEGF在膽囊炎、膽囊腺瘤和膽囊腺癌組織中的表達 在10例膽囊炎和膽囊腺瘤組織中,pAKT和VEGF陽性表達率分別為20.0%(2/10)、40.0%(4/10)和40.0%(4/10)、60.0%(6/10)。在慢性膽囊炎,pAKT陽性細胞主要呈灶性分布于膽囊黏膜腺體,腺體之間的間質散在的陽性;VEGF陽性細胞除膽囊黏膜腺體外,腺體之間的間質和血管也可見散在的陽性(圖1)。在膽囊腺瘤,pAKT和VEGF陽性細胞表達范圍和強度明顯增加(圖2)。46例膽囊腺癌pAKT和VEGF的陽性表達率分別為87.0%(40/46)和91.3%(42/46)。膽囊腺癌pAKT和VEGF陽性細胞彌漫并多聚集成團(圖3,4)。從整體看,膽囊炎和膽囊腺瘤組織中pAKT和VEGF陽性反應強度和范圍較癌組織明顯減弱。膽囊炎、膽囊腺瘤和膽囊腺癌中pAKT和VEGF的陽性表達率有非常顯著性差異(P＜0.01),見表1。

2.2 pAKT、VEGF表達與膽囊腺癌臨床病理參數及微血管和微淋巴管密度關系 pAKT的陽性表達與臨床分期和淋巴結有無轉移顯著相關,統計學有顯著性差異(P＜0.05)。MVD與腫瘤生長方式和臨床分期顯著相關(P＜0.05;P＜0.01);MLD與腫瘤生長方式和淋巴結有無轉移有非常顯著差異(P＜0.01)見表2。腫瘤組織中的微血管在腫瘤中央區及周邊區均均勻分布,并呈不同程度的擴張狀態,尤其在浸潤癌組織周圍微血管較多(圖5)。腫瘤組織中淋巴管主要分布在腫瘤邊緣區,該區淋巴管分布較為密集呈不同程度的擴張狀態,甚至可見淋巴管內的瘤栓,而腫瘤中心區淋巴管分布較稀疏,多呈條索狀,甚至是殘缺狀態或未見有淋巴管分布(圖6)。

表1 pAKT和VEGF在膽囊腺癌旁組織及膽囊腺癌中的表達(例,%)

表2 pAKT、VEGF表達與膽囊腺癌臨床病理參數及微血管、微淋巴管的關系

2.3 膽囊腺癌組織pAKT、VEGF陽性表達與MVD和MLD的相關性 40例pAKT陽性組的MVD為29.6±5.4,陰性組MVD為 23.5±4.2,陽性組的MVD明顯高于陰性組;42例VEGF陽性組的MVD為29.5±5.2,4例陰性組MVD為22.3±3.6,兩組的MVD之間有顯著性差異,Spearman相關分析表明膽囊腺癌的pAKT和VEGF表達與MVD呈正相關。pAKT陽性組的MLD為8.0±2.4陰性組MLD為4.6±1.9,陽性組的MVD明顯高于陰性組;42例VEGF陽性組的MLD為7.9±2.5,4例陰性組MVD為7.8±2.9,兩組的MLD之間無顯著性差異,Spearman相關分析表明膽囊腺癌的pAKT表達與MLD呈正相關,見表 3。

表3 pAKT、VEGF表達與膽囊腺癌微血管及微淋巴管的相關分析(Spearman相關分析)

圖1 慢性膽囊腺炎組織pAKT陽性表達,SP×100

圖2 慢性膽囊腺炎組織pAKT陽性表達,SP×100

圖3 膽囊腺癌組織pAKT呈陽性表達,SP×200

圖4 膽囊腺癌組織VEGF呈陽性表達,SP×200

圖5 膽囊腺癌組織微血管密度,SP×100

圖6 膽囊腺癌組織微淋巴管密度,SP×100

3 討論

本實驗中,免疫組化的結果表明,膽囊腺癌pAKT、VEGF陽性表達率明顯高于慢性膽囊炎和膽囊腺瘤,它們之間的陽性表達率有非常顯著性差異(P＜0.01)。pAKT的陽性表達與臨床分期和淋巴結轉移顯著相關,統計學有顯著性差異(P＜0.05)。MVD與腫瘤生長方式和臨床分期顯著相關;MLD與腫瘤生長方式和淋巴結轉移有非常顯著差異(P＜0.01)。pAKT和VEGF陽性組的MVD明顯高于其陰性組,Spearman相關分析表明膽囊腺癌的pAKT和VEGF表達與MVD呈正相關。pAKT陽性組的MLD的MVD明顯高于陰性組,Spearman相關分析表明膽囊腺癌的pAKT表達與MLD呈正相關,而VEGF陽性組的MLD與陰性組之間無顯著性差異。這些結果揭示pAKT、VEGF和膽囊腺癌的發生發展密切相關。到目前為止,pAKT促進腫瘤發生發展的機制并不完全清楚,現在的研究提示可能是通過促進腫瘤組織中血管和淋巴管的新生而影響[8,9]。眾所周知,腫瘤的發生發展和轉移依賴于新生血管和淋巴管的形成,從本實驗結果分析,pAKT主要通過VEGF影響了膽囊腺癌的微血管和微淋巴管的生成。現有的研究結果表明,主要是在血管生成因子VEGF和PDGF的作用下,腫瘤細胞通過EGF(epidermal growth factor,表皮生長因子)/PI3K/AKT/FRAP通路促進腫瘤血管和微淋巴管形成和生長。也有學者提出pAKT可通過其它途徑影響膽囊腺癌的發生、微血管和微淋巴管生成和轉移[10,11]。我們的結果提示MLD在膽囊腺癌的轉移中的作用密切相關,而MVD可能與腫瘤的生長關系更為密切。

綜上所述,PI3K/AKT信號傳導通路參與了膽囊腺癌的發生發展,其中pAKT可能通過調節VEGF而影響膽囊腺癌新生血管和微淋巴管的形成,從而與其轉移密切相關,這提示阻斷PI3K/AKT信號傳導通路將對膽囊腺癌的治療提供新的靶點。

[1]周曉東,于皆平,于紅剛,等.蛋白激酶B在胃癌中的表達及其生物學意義[J].中華消化雜志,2005,25(7):401.

[2]Yamamoto K,Tomita Y,Hoshida J,et al.Prognostic significance of activated AKT expression in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(8):2846.

[3]Grabacka M,Plonka PM,Urbanska K,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activation decreases metastatic potential of melanoma cells in vitro via down-regulation of Akt[J].Clin Cancer Res.2006,12(10):3028.

[4]0ka N,Tanimoto S,Taue R,et al.Role of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in bladder cancer cell apoptosis induced by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Cancer Sci,2006,97(10):1093.

[5]Shinohara M,Chung YJ,Saji M,et al.AKT in thyroid tumorigenesis and progression[J].Endocrinology 2007,148(3):942.

[6]Kajiya K,Hirakawa S,Ma B,et al.Hepatocyte growth factor promotes lymphatic vessel formation and function[J].EMBO J,2005,24(16):2885.

[7]Jiang WG,Davies G,Martin TA,et al.The Potential lymphangiogenic effects of hepatocyte growth factor/scatter factor invitro and in vivo[J].Int J Mol Med,2005,16(4):723.

[8]Kobayashi I,Semba S,Matsuda Y,et al.Significance of Akt phosphorylation on tumor growth and vascular endothelial growth factor expression in human gastric carcinoma[J].Pathobiology 2006,73(1):8.

[9]Hu L,Hofmann J,Jaffe RB.Phosphatidylinositol 3-kinase mediates angiogenesis and vascular permeability associated with ovarian carcinoma[J].Clin Cancer Res 2005,11(22):8208.

[10]Agarwal A,Das K,LernerN,Sathe S,et al.The AKT/I?B kinase pathway promotes angiogenic/metastatic gene expression in colorectal cancer by activating nuclear factor-κ B and β-catenin[J].oncogene,2005,24(6):1021.

[11]Korner A,Mudduluru G,Manegold C,et al.Enzastaurin inhibits invasion and metastasis in lung cancer by diverse molecules.[J].Br J Cancer,2010;103(6):802.