Survivin和Caspas3在側(cè)向發(fā)育型大腸腫瘤中的表達(dá)

吳曉冬,張 斌,李長鋒,楊 蕾,李丹丹,丁 夢

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院1.中心研究室;2.內(nèi)鏡中心,吉林長春130033)

大腸癌在我國是高發(fā)腫瘤之一,而且大腸腫瘤有一個(gè)從“腺瘤-癌順序?qū)W說”,所以有很多學(xué)者致力于研究癌基因、抑癌基因及凋亡相關(guān)基因等在大腸癌變過程中的改變,并且得出結(jié)論:它們?cè)诖竽c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中演繹著重要角色。隨著放大內(nèi)鏡及其內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)(EMR)等技術(shù)的臨床應(yīng)用,大腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤(laterally spreading tumor,LST)逐漸受到人們的注意,其主要特性為病變主要沿黏膜面?zhèn)认虮頊\生長,而不是向腸壁深層垂直生長[1]。

由于對(duì)LST認(rèn)識(shí)不足,現(xiàn)國內(nèi)外對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)的研究,LST由于其具有沿黏膜水平生長的特點(diǎn),認(rèn)為可能與腫瘤細(xì)胞的異常增殖及凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡受凋亡促進(jìn)因子和凋亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。Caspase是細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制,其級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活決定了凋亡形態(tài)的變化。而Survivin是近些年發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤特異性凋亡抑制因子,故本研究擬探討良性LST與垂直生長的大腸腺瘤間凋亡相關(guān)基因Caspase3和Survivin的表達(dá)異同。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 LST、大腸腺瘤、大腸腺癌及正常組織標(biāo)本均取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院內(nèi)鏡中心和基本外科2002-2006年治療和診斷的患者,術(shù)前均未接受過化療及放療,由病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)查確診。其中23例良性LST患者:男性13例,女性 10例,年齡27-75歲,平均年齡53.6歲;34例大腸腺瘤患者:男性19例,女性15例,年齡22-74歲,平均年齡49.7歲;21例大腸腺癌患者:男性12例,女性9例,年齡34-78歲,平均年齡58.7歲;11例正常黏膜組織標(biāo)本取自距腫瘤邊緣10cm以上的正常黏膜組織。

1.2 免疫組化染色 SP免疫組化試劑盒及Caspase3、Survivin兔抗人多克隆抗體均購自福州邁新生物工程公司,DAB顯色試劑盒購自博士德生物工程公司,按照試劑盒說明進(jìn)行免疫組化檢測。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,用已知陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 圖象分析儀進(jìn)行圖象分析,每張圖片選擇5個(gè)視野,測定陽性蛋白的吸光度值并判斷陽性率。Survivin和Caspase3蛋白均定位于細(xì)胞漿內(nèi),免疫組織化學(xué)染色陽性反應(yīng)為黃-棕黃色顆粒。雙盲法看片,參照Kawasaki等[2]采用的半定量積分方法判斷結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,P＜0.05表示差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin表達(dá) 良性LST組(陽性率21.7%,吸光度122.3±13.55)和大腸腺瘤組(陽性率20.6%,吸光度126.8±12.26)表達(dá)明顯低于大腸腺癌組(陽性率61.9%,吸光度 107.7±10.24)(P＜0.05),而良性LST組與腺瘤組間未見顯著差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 正常大腸黏膜和大腸腫瘤組織中Survivin基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)

2.2 Caspase3表達(dá) 良性LST組(陽性率60.9%,吸光度值106.8±15.77)和腺瘤組(陽性率64.7%,吸光度值108.5±15.63)明顯高于腺癌組(陽性率42.9%,吸光度值129.5±8.67)(P＜0.05),Caspase3在正常黏膜中廣泛表達(dá)于胞漿中,而良性LST組與腺瘤組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05)(見表2)。

表2 正常大腸黏膜和大腸腫瘤組織中Caspase3基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)

3 討論

Survivin是IAP(inhibitor of apoptosis proteins)家族的新成員,Survivin僅有一個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)區(qū)結(jié)構(gòu)(Baculorirus IAP Repeat,BIR),沒有羧基末端環(huán)指結(jié)構(gòu),代之的是羧基末端卷曲結(jié)構(gòu)。Survivin基因定位于17q25[3],是功能類似Bcl-2的抑制凋亡基因。有研究表明Survivin調(diào)節(jié)線粒體釋放細(xì)胞色素c抑制凋亡,也可直接與 caspase3和 caspase7結(jié)合,使caspase的活性降低而抑制凋亡,也有報(bào)道Survivin還可以調(diào)節(jié)G2/M細(xì)胞周期,主要以細(xì)胞周期依賴的形式過度表達(dá)于G2/M期[4]。另外,Survivin有保護(hù)細(xì)胞、維持微管結(jié)構(gòu)完整性的作用。總之,Survivin是在正常組織中不表達(dá),在胚胎時(shí)期高表達(dá),在惡性腫瘤發(fā)生時(shí)又重新表達(dá)的一類因子,可以使腫瘤細(xì)胞免于凋亡,加速其多倍體的形成,促進(jìn)腫瘤生成。

本實(shí)驗(yàn)證明了在LST中有Survivin的高表達(dá)。且從正常大腸黏膜到腺瘤、LST以及最終癌變的發(fā)展過程中Survivin表達(dá)逐漸增加,而良性LST與腺瘤在表達(dá)上沒有顯著差異(P＞0.05)。與Lin等[5]的研究結(jié)果一致,由此也說明其重新表達(dá)的時(shí)機(jī)為腫瘤發(fā)生的早期,所以我們考慮Survivin過度表達(dá)是大腸癌發(fā)生的早期事件之一,即在腺瘤早期Survivin已被激活,表達(dá)出大量Survivin蛋白,抑制細(xì)胞凋亡,延長腫瘤細(xì)胞生存期,無論是水平生長還是垂直生長的大腸腫瘤都有其表達(dá)。這使得Survivin成為大腸腫瘤的早期診斷指標(biāo)之一。

由于Survivin的抗凋亡功能主要是通過在Bcl-2的下游干擾 caspase-9或直接抑制caspase3和caspase7的活性來實(shí)現(xiàn)[4],Caspase家族是一種半胱氨酸蛋白酶家族,其家族成員有十余種,它們激活某些酶或破壞細(xì)胞骨架等方式導(dǎo)致一系列凋亡相關(guān)反應(yīng)及細(xì)胞形態(tài)改變。Caspase是以酶原形式存在的,只有被激活才能發(fā)揮作用,活化的Caspase再通過裂解相應(yīng)的一系列底物而引起細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為與Caspase有關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑至少有三種:細(xì)胞色素c途徑、死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑,其共同途徑都是最終激活Caspase3。所以Caspase3是Caspase凋亡途徑中的核心成員。Caspase總是與其抑制劑共存,以防止Caspase酶原意外激活而對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。Survivin即被認(rèn)為是Caspase的抑制劑之一。故我們同時(shí)檢測了Caspase3的在大腸腫瘤中的表達(dá)。Caspase3在正常黏膜高表達(dá),隨著大腸腫瘤的發(fā)生,腺瘤組及良性LST組Caspase3表達(dá)降低,大腸癌組的Caspase3表達(dá)明顯降低。說明Caspase3的表達(dá)受到抑制,從而也抑制了凋亡途徑,使腫瘤生長。證明了LST組織細(xì)胞凋亡的改變也是由于多種基因協(xié)同作用的結(jié)果。

以上結(jié)果在良性LST與大腸腺瘤間未見Caspase3、Survivin等基因的差異改變,考慮LST與大腸腺瘤同樣是癌前病變,LST同樣存在多基因改變,同時(shí)由于LST在內(nèi)鏡下容易被忽視,故提示內(nèi)鏡工作者在工作中,要提高警惕,以防漏診。另外,由于內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展,特別是內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(ESD)及內(nèi)鏡黏膜下切除術(shù)(EMR)的應(yīng)用[6],也使其盡早診斷,急早治療成為可能。

[1]Kudo S,About laterally spreading tumor[J].Early colorectal Cancer,1998,2(5):477.

[2]Kawasaki H,Altieri DC,L u CD,et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer[J].Cancer Res,1998,58(22):5071.

[3]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8):917.

[4]Tamm I,Wabg Y,Saysville E et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activite and apoptosis induced by Fas(CD95),Bax,caspases,and anticancer drugs[J].Cancer Res,1998,58:5315.

[5]Lin Li,Zheng CQ,Jin Y,et al.Expression of survivin protein in human colorectal carcinogenesis[J].World J Gastuoenterol 2003,9:974.

[6]Iizuka H,Okamura S,Onozato Y,et al.Endoscopic submucosal dissection for colorectal tumors[J].Gastroenterol Clin Bilo,2009,33(10-11):1004.