小飛蓬活性成分對乳腺癌MCF-7細胞的作用

吳珊珊,郭,張麗紅,邱心如,王醫術*,嚴銘銘

(1.吉林大學病理生物學教育部重點實驗室,吉林長春130021;2.吉林大學藥學院2009級,3.長春中醫藥大學)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,在我國占全體惡性腫瘤的7%-10%[1],嚴重威脅婦女身心健康甚至危及生命。而據文獻報道,中藥小飛蓬除了具有較強的抗氧化,抗衰老,抗突變,調血脂的藥理作用外,還具有較強的抗腫瘤作用。因此,本實驗研究小飛蓬活性物質對乳腺癌MCF-7細胞的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 人乳腺癌MCF-7細胞,購于上海中科院細胞研究所。

1.1.2 主要試劑 CCK-8購至Dojindo公司;5-氟尿嘧啶購至天津金耀氨基酸公司;免疫組織化學染色試劑盒購至福州邁新生物技術公司;MMP-9購至BD公司,Caspase-3購至Gene公司;小飛蓬活性物質由長春中醫學院提取提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MCF-7細胞培養于含10%FCS的H-DMEM培養基中。

1.2.2 CCK-8試劑盒測定藥物對細胞生長的抑制作用 取對數生長期的MCF-7細胞,以2×104?mL-1加入96孔板內,0.1 mL-1孔。小飛蓬作用組按照濃度 1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04 mg.L-1分成 6組,每組設 2個平行孔;5-FU為陽性對照,按照0.025 、0.0125 、0.00625 、0.003125 、0.001563 、0.000782 mg?mL-1分成6組,每組亦設2個平行孔;設2個不加藥的為陰性對照。常規培養72 h后,小心吸棄上清,每孔加入含 10 μ L CCK-8 的 RPMI-1640 0.1 mL。另設一孔僅加入含 10 μ L CCK-8的 RPMI-1640 0.1 mL為空白對照孔,37℃、5%CO2培養3 h后,在Biored 550酶標儀上以空白對照孔調零后,在490 nm波長下測定吸光光度值(A值),計算小飛蓬及5-FU對MCF7的生長抑制率,求出IC50。細胞生長抑制率(%)=(對照孔A值—加藥孔A值)/對照孔A值×100%。

1.2.3 繪制生長曲線 取對數生長期MCF-7細胞,調整細胞濃度為9×104?mL-1,接種。根據 IC50值,小飛蓬組設3個濃度組,分別為低劑量組(1/2 IC50值)、中劑量組(IC50值)、高劑量組(2×IC50值),陽性對照組5-FU濃度為IC50值,陰性對照組不加藥(0mg?mL-1)。每個濃度設3個復孔,37℃、5%CO2孵育。共計數7天,繪制生長曲線。

1.2.4 免疫細胞化學染色 常規細胞爬片(細胞密度及藥物濃度等同于生長曲線)。將爬片水化后,0.3%Triton-X100 40μ L,作用 18m in 后 EDTA 修復液修復,沖洗后滴加阻斷劑20 min,血清覆蓋15 min,直接加入一抗(稀釋比例為1∶200),4℃過夜。按說明滴加二抗、三抗后DAB發色。蘇木精復染細胞核,常規脫水透明,中性樹脂封片。結果判定:Caspase-3、MMP-9均以胞漿內出現棕黃色顆粒者為陽性。每張爬片選5個不同視野采集圖像。統計陽性細胞的灰度值,單位為像素。

2 結果

2.1 小飛蓬對MCF-7細胞的抑制作用

CCK-8試劑盒檢測結果顯示,小飛蓬對MCF-7細胞的生長有抑制作用,且抑制作用隨小飛蓬濃度的升高而增大,其 IC50值為 0.29 mg?mL-1,5-FU對MCF-7細胞的IC50值為0.0022 mg?mL-1,P ＜0.05。結果見表1、2。

2.2 小飛蓬作用MCF-7細胞的生長曲線

選擇不同藥物濃度作用的MCF-7細胞繪制生長曲線,結果顯示,小飛蓬對MCF-7細胞的生長有明顯劑量依賴性抑制作用,與對照組相比差異明顯(P＜0.05),與現有陽性對照藥5-FU相比無顯著性差異(P＞0.05)。結果見圖1。

表1 小飛蓬對MCF-7細胞的生長的抑制

表2 5-FU對MCF-7細胞的抑制作用

2.3 MCF-7細胞形態的變化

倒置相差顯微鏡下觀察藥物作用后細胞形態改變:對照組(0 mg?mL-1)細胞,呈三角形或多角形,粘附性好,折光性強。小飛蓬低劑量組(0.145 mg?mL-1)細胞呈多角型,死亡較少,粘附性好,折光性較強,狀態較好;小飛蓬中劑量組(0.29 mg?mL-1)細胞變長,死亡較多,粘附性減弱,折光性減弱;小飛蓬高劑量組(0.58 mg?mL-1)細胞變長,死亡更多,折光性差。5-FU在濃度為0.0022 mg?mL-1時,細胞呈不規則形,有部分細胞死亡,折光性減弱。結果見圖4。

圖1 小飛蓬作用MCF-7細胞的生長曲線

圖2 小飛蓬作用后24小時后MCF-7細胞的狀態(×200)

2.4 MCF-7細胞中Caspase-3的表達

對照組無Caspase-3表達為陰性,小飛蓬組Caspase-3表達較強,隨著濃度的增加表達增強,5-FU組為弱表達,小飛蓬2個組Caspase-3表達高于對照組(P ＜0.001),小飛蓬高劑量組(0.58 mg?mL-1)、中劑量組(0.29 mg?mL-1)Caspase-3表達與5-FU(P＜0.01)相近,無統計學意義。結果見表3,圖3。

表3 MCF-7細胞中Caspase-3的表達

2.5 MCF-7細胞中MMP-9表達情況

MMP-9免疫細胞化學染色結果提示,對照組MMP-9表達為強陽性,小飛蓬組表達弱于對照組,且隨著濃度的增高,表達下降(P＜0.001)。結果見表4及圖4。

表4 MCF-7細胞中MMP-9的表達

圖3 Caspase-3在MCF-7細胞中的表達(×200)

圖4 MMP-9在MCF-7細胞中的表達(×200)

3 討論

乳腺癌已成為我國婦女中發病率最高的惡性腫瘤,雖有手術、放療、化療、生物療法等多種方法,但中藥的抗癌作用日益受到人們的重視[2]。小飛蓬(Erigeron canadensis L.)又名祁州一枝蒿、蛇舌草、竹葉艾、魚膽草、苦蒿,是菊科飛蓬屬的一年生草本植物,廣泛分布于中國各地。有文獻記載小飛蓬的藥用有清熱利濕、散瘀消腫、改善腎的微循環的功效并且還具有較強抗腫瘤的藥理作用[3]。黃酮類成分為小飛蓬抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、治療心腦血管疾病的主要有效部位[4]。但迄今為止,小飛蓬對MCF-7是否有抑制作用未見報道。本研究通過體外實驗觀察小飛蓬對MCF-7細胞生長抑制作用。本研究應用CCK-8試劑盒測得小飛蓬可以抑制人乳腺癌MCF-7細胞生長,IC50值為 0.29 mg?mL-1;進一步通過繪制MCF-7細胞生長曲線觀察到,小飛蓬對MCF-7細胞的生長有明顯劑量依賴性抑制作用。形態學觀察發現小飛蓬作用后MCF-7細胞形態的改變,細胞由多角型、附壁性好逐漸變長,死亡多,胞漿內顆粒增多,折光性差。上述結果均表明小飛蓬可抑制MCF-7生長,并降低細胞粘附性和鋪展能力。Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶簡稱,在正常狀態下以無活性的酶原形式存在。當在凋亡信號刺激下被激活,上游的Caspase有次序的激活下游的Caspase,形成Caspase級聯反應,將凋亡信號傳遞到凋亡底物。1993年首次發現Caspase參與細胞凋亡過程以來,大量研究表明,Caspase-3在細胞凋亡過程中處于中心地位,是細胞凋亡的主要效應因子[5,6]。Caspase-3蛋白酶是凋亡中最重要的因子,其在Caspase級聯反應中處于核心地位,Caspase-3的剪切活化是細胞凋亡發生的關鍵步驟及一切凋亡信號傳導的共同通路,所以該蛋白酶也被稱為死亡蛋白酶[7]。本研究通過免疫細胞化學染色檢測 Caspase-3在MCF-7細胞中的表達。研究結果表明,小飛蓬作用細胞后Caspase 3的活性明顯強于對照組,并呈劑量依賴。因而,我們得出結論,小飛蓬體外對MCF-7細胞的生長抑制作用是通過激活Caspase 3誘導細胞凋亡而實現的。在腫瘤侵襲、轉移的復雜過程中,基質金屬蛋白酶(MMPs)起著重要的作用。而MMP-2、MMP-9能降解明膠和IV 、V、Ⅶ、X 型基底膜膠原,允許內皮細胞降解并浸潤血管基底膜,產生ECM降解產物,從而趨化內皮細胞,激活并固定ECM中的生長因子[8]。研究者在腫瘤的浸潤、轉移方面發揮著極為重要的作用[9]。閆承慧等在體外培養肺腺癌細胞系,結果發現腺癌細胞產生MMP的能力與其轉移能力有一定相關性,轉移能力相對高的細胞系中MMP-2與MMP-9的活性均較高,而轉移能力相對較低的細胞系中則只表達MMP-2,不表達MMP-9[10]。表明MMP-9的表達與腫瘤高轉移能力更為相關。本研究體外實驗MMP-9免疫細胞化學染色結果提示,對照組MMP-9表達為強陽性,小飛蓬組表達弱于對照組,且隨著濃度的增高,表達下降。說明小飛蓬在體外可抑制MCF-7細胞MMP-9的表達,從而抑制其侵襲能力。

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