AZT對胃癌細胞SGC7901端粒酶活性的影響

于金海,劉國輝

(吉林大學白求恩第一醫院1.胃腸外科;2.急診科,吉林 長春130021)

近幾年的研究顯示通過抑端粒酶活性,干預端粒酶的激活過程,阻斷腫瘤細胞的亞性轉化,在腫瘤治療上有重要意義和巨大的潛力[1]。本研究通過端粒酶抑制劑3-疊氮脫氧胸苷(3-azido-deoxythymidine,AZT)作用于人胃癌細胞SGC7901,比較AZT作用后癌細胞端粒酶活性的變化,并利用缺口末端標記技術【terminal deoxyribonucleotidyl transferse(TdT)-mediated biotin-16dUTP nick end labeling,TUNEL】和流式細胞術檢測AZT作用后腫瘤作用后胃癌細胞SGC7901凋亡情況,進而探討AZT抑制腫瘤細胞端粒酶可能的機制,為端粒酶抑制劑的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞

人胃癌細胞株SGC7901及其培養基由中國醫學科學院腫瘤醫院提供。

1.2 主要試劑和儀器

AZT為德國默克公司產品;1250胰蛋酶為羅氏診斷產品(上海)有限公司產品;新生牛血清購自武漢達邦生物科技有限公司;注射用青霉素鈉購自山東魯抗醫藥股份有限公司;注射用硫酸鏈霉素購自大連美羅大藥廠;PBS購自武漢博士德生物公司;DMSSO購自廣州新港化工有限公司;DEPC購自上海生物工程技術服務有限公司;SYBR Green I熒光染料購自上海物工程技術服務有限公司;端粒酶活性檢測試劑盒(TRAP-ELISA)為Sigma產品;細胞凋亡檢測試劑盒購自BoehringerMannheim公司;Annexin V-FITC試劑盒購自 Beckman Coulter公司;美國Bio-Rad公司的icycleriQ實時熒光定量PCR儀;德國Leica的DMR+Q550病理圖像分析儀;美國Becton Dickinson,FACS Calibur流式細胞儀;

1.3 細胞培養液及細胞毒性實驗(MTT法)

具體操作方法參見文獻[2]。實驗組為AZT處理的胃癌細胞SGC7901,對照組為不加任何處理因素的胃癌細胞SGC7901。MTT作用濃度分別為:2 mmol/L,4 mmol/L,8 mmol/L,16 mmol/L,32 mmol/L,作用時間分別為:12 h,24 h,36 h,48 h。通過MTT實驗確定AZT作用最佳作用濃度和時間。

1.4 實時熒光定量端粒重復序列擴增(real-time fluorescent quantitative TRAP assay,FQ-TRAP)法檢測端粒酶活性

1.4.1 端粒酶提取液的準備 收集實驗組和對照組細胞,調整細胞密度為1×106/ml,參照端粒酶TRAP-ELISA試劑盒說明書操作。

1.4.2 實時熒光定量PCR反應體系包括 反應混合物(TRAP-ELISA 試劑盒溶液 2)12.5 μ l,模板 1 μ l,20×SYBR Green I 1.25 μ l,焦碳酸二乙酯(DEPC)水10.25 μ l。25℃引物延伸 30 min,94℃端粒酶滅活 5 min,94 ℃30 s、50℃30 s、72℃90 s,共進行 40個循球,最后72℃延伸10 min,實驗重復4次。

1.4.3 結果判定 以4次實驗平均閥限循環值(cycle threshold,CT)(±s)表示端粒酶活性。CT值大者,模板數小,表示端粒酶活性低。CT值小者,模板數大,表示端粒酶活性高。用SPSS10.0For windows軟件進行數據的統計公析。根據實驗組CT值對照CT值,可計算AZT作用后癌細胞端粒酶活性下調率。計算公式為:端粒酶活性下調率=(實驗組平均CT值-對照組平均 CT值)/對照組平均CT值×100%。

1.5 細胞凋亡檢測

1.5.1 TUNEL法檢測細胞凋亡 收集實驗組和對照組細胞,消化制成1×105/ml的單細胞懸液。按照試劑盒說明書的要求進行操作。Leica病理圖像分析儀進行凋亡分析,以細胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細胞。400倍光鏡下隨機計數300個細胞計算凋亡細胞的比率。

1.5.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集實驗組和對照組細胞,消化制成單細胞懸液。按照Annexin V-FITC試劑盒說明書進行操作。在流式細胞儀上記錄激發波長488 nm處的紅色熒光。

2 結果

2.1 AZT的作用濃度、作用時間與細胞抑制率的關系

MTT實驗結果見表1。

表1 不同濃度AZT作用于SGC7901胃癌細胞后細胞存活率

2.2 FQ-TRAP法檢測AZT作用后癌細胞端粒酶活性變化

以16 mmol/L濃度AZT作用于SGC7901胃癌細胞36 h后,FQ-TRAP檢測顯示,實驗組CT值為31.0±0.8,對照組CT值為16.5±0.6兩組有顯著性差異(P＜0.001)。這說明AZT對SGC7901胃癌細胞的端粒酶活性有明顯的抑制作用。同時計算端粒酶活性的下調率,結果顯示AZT對SGC7901胃癌細胞端粒酶活性的下調率為54.7%。

2.3 細胞凋亡的檢測

AZT作用36 h后,利用TUNEL法在光學顯微鏡下觀察到實驗組出現典型的凋亡細胞形態學變化,即貼壁由伸展的鋪路石樣變為橢圓形,細胞體積縮小,細胞之間的聯接變得松散,部分貼壁的細胞開始脫壁;而對照組沒有出現此類改變(見圖1,2)Annexin V-FITC法檢測腫瘤細胞凋亡率,對照組的凋亡率為1.43%,實驗組凋亡率為14.6%(見圖3,4)。

圖1 AZT作用36 h后凋亡細胞形態變化

圖2 對照組36 h后凋亡細胞形態變化

圖3 流式細胞術檢測AZT作用后凋亡率

圖4 流式細胞術檢測對照組凋亡率

3 討論

端粒酶是合成端粒酶DNA的特殊逆轉錄酶,具有RNA依賴性和DNA多聚酶性質的核糖蛋白復合體,能以自身RNA為模板,不斷合成端粒DNA序列,保持染色體端粒的完整性。研究顯示,在幾乎所有惡性腫瘤及永生細胞中都有陽性表達,而在絕大部分正常體細胞(除生殖細胞、造血干細胞及表皮基底細胞等少數細胞外)及良性腫瘤組織中則為陰性或表達率極低,它是目前已知的最廣譜的惡性腫瘤標志物之一[3,4]。端粒酶活性與惡性腫瘤之間的高度相關性使端粒酶成為近年來腫瘤治療研究的新熱點,端粒酶活性高低與腫瘤的治療及預后有一定關系,對端粒酶活性的抑制是治療惡性腫瘤的可能新途徑之一[5,6]。

AZT屬核苷類似物,是一種逆轉錄酶的抑制劑,可以和正常的單核苷酸競爭與RNA模板結合并抑制細胞內部逆轉錄酶的活性,在DNA復制時亦可摻入繼而使復制過程中止,因此,AZT可以抑制多種腫瘤細胞的端粒酶活性,從而達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。研究發現,AZT對體外培養的肝癌細胞、結直腸細胞、乳腺癌及肺癌細胞均有抑制作用。本研究觀察到AZT在體外可以明顯抑制SGC7901胃癌細胞的端粒酶活性,對其端粒酶活性下調率為54.6%,這與相關研究的結果是一致的。

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