SYK基因激活對人胃癌SGC7901細胞株VEGF表達的影響

于慶功,鄭清華,李明強,舒 敏,王 偉,劉春英

(大連大學附屬中山醫院消化科,遼寧大連116001)

在我國,絕大部分胃癌患者就診時已屬晚期,其治療難點之一是如何預防和治療腫瘤的轉移。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)是B細胞信號轉導途徑中重要的激酶,與T細胞的ZAP-70屬于同一個PTK家族,在T細胞和B細胞的成熟、活化、免疫應答的過程中起關鍵作用[1]。有研究認為Syk不但是免疫調節因子,對惡性腫瘤的生長和轉移也可能有抑制作用[2]。國內外研究已證實,Syk能夠抑制乳腺腫瘤細胞的生長和轉移,Syk基因的表達降低或缺失與正常乳腺組織向惡性細胞發展有關[3]。有研究認為Syk基因是胃癌的抑制基因[4],其表達缺失與胃癌的發生以及轉移相關,但其缺失的原因至今未明。抑癌基因啟動區CpG島(基因啟動子內含有的CpG,C-G相鄰,p為二酯鍵)的甲基化是抑癌基因表達缺失的主要原因之一[5],而甲基轉移酶(DAN methyltransferase enxyme,DNMT)抑制劑 5-氮2'-脫氧胞苷(5-aza-CDR)具有逆轉SYK基因甲基化的作用[6]。為了進一步研究Syk基因的表達對胃癌的生物學作用,本研究擬探索5-氮2'-脫氧胞苷(5-aza-CDR)能否逆轉人胃癌SGC-7901細胞株Syk基因的甲基化,激活的Syk基因是否對胃癌的生長及血管內皮生長因子(VEGF)的表達有抑制作用,從而探討Syk基因抑制胃癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌SGC-7901細胞株購自中國科學院上海生化所;5-氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-CDR)購自美國Sigma公司,用含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)配制成貯存液,-70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胃癌SGC7901細胞株常規培養于含10%小牛血清,100 IU/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的RPM1640培養液中,于37℃,5%CO2培養箱中培養。每3-4天用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次。

1.2.2 MTT細胞增殖實驗 取1×105/ml的對數生長期細胞,配成密度為1×104/ml的細胞使用液,分別接種于3塊96孔培養板,每塊板分5組,每組3復孔,每孔200 μ l,另取3個孔加入不含細胞的培養液100 μ l作為空白調零。在37℃、5%CO2培養箱中培養過夜,細胞完全貼壁后,小心吸棄培養液同時進行分組處理:(1)空白對照組只加培養液;(2)0.5 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(3)1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(4)2.0 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(5)4.0 μ mol/L 5-aza-CDR組(0.5-4.0 μ mol/L為5-aza-CDR在培養液中的濃度)。培養3天后去藥,加入培養液繼續培養,自去藥開始每隔24 h取出一塊板,每孔加入0.5%MTT液20 μ l,再培養4 h后,小心吸除孔內液體,每孔加入二甲基亞砜150 μ l,立即置入自動酶標儀中,震蕩后于492 nm波長下測定各孔的吸光度值(A492)。

1.2.3 RT-PCR 將密度為1×105/ml的細胞接種于12個25 cm2培養瓶,每瓶10 ml,37℃、5%CO2條件下培養24 h后,棄去原有培養液,PBS溶液沖洗2次。分成4組,每組3瓶,換液后每瓶仍為10 ml。分組情況以及所更換含藥培養液中藥物終濃度如下:(1)空白對照組只加培養液;(2)0.5 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(3)1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 組 ;(4)2.0 μ mol/L 5-aza-CDR組。培養3天后去藥,加入培養液繼續培養培養3天。按TRIZOL(Gibco)說明書操作分別提取不同藥物濃度作用后的SGC7901細胞總RNA。檢測人胃癌SGC7901細胞株Syk基因的表達情況:引物正義鏈:5'-AAGCAAATGTCAGTCAGTCATGCAGCAG-3'Syk反義鏈:5'-TCATCCCTCGATATGGCTTC-3',擴增產物大小471 bp,94℃預變性5 min,94℃變性45 s,61℃退火1 min,72℃延伸45 s,30個循環后72℃延伸7 min。擴增產物-70℃保存。檢測細胞VEGF的表達:(1)cDNA的合成:oligdT 1 μ l,dNTP 1 μ l,逆轉錄緩沖液 5 μ l,DEPC-H2O 6.5 μ l,RNA 10 μ l,Rnasin 0.5 μ l,MMV 1 μ l。 置于37℃水浴2 h,95℃5 min。(2)PCR:VEGF上游引物5'-ATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3',下游引物5'-TGCATGGTGATGTTGGAC-3',擴增產物大小382 bp,內參β-actin的上游引物為:5'-GGGACCTGACTGACTACCTC-3',下游引物為:5'-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCTG-3',擴增產物大小546 bp。VEGF和βactin上下游引物均由大連TaKaRa生物工程公司合成 。PCR 擴 增體系 50 μ l。DEPC-H2O 41.5 μ l,PCR緩沖液 5 μ l,上下游引物各 1 μ l,cDNA 1 μ l,Taq 酶 0.5 μ l。PCR 反應條件:變性95℃45 s,退火95℃45 s,54℃45 s,72℃45 s,循環35次。延伸72℃10 min。擴增產物-70℃保存。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后,將膠板在凝膠成像分析系統下拍照并進行定量分析。電泳過程重復3次,記錄定量分析數據。

1.3 統計學處理

根據實驗性質,實驗數據以均數±標準差(MEAN±SD)表示,數據用SPSS13.0統計軟件處理。組間比較用方差分析,P＜0.05認為差異有顯著性。

2 結果

2.1 MTT細胞增殖實驗

接受5-aza-CDR激活SYK基因作用后的人胃癌SGC7901細胞生長增殖明顯受抑,細胞生長增殖受抑制程度在一定藥物濃度范圍內呈現時間、劑量依賴性。從數據分析中得出,相同時間,1.0 μ mol/L組第 2 天和第 3 天 、2.0 μ mol/L 組和 4.0 μ mol/L 組與對照組相比差異顯著(P＜0.01);相同濃度,與第1天相比較 ,1.0 μ mol/L 組第 3 天 、2.0 μ mol/L 組和 4.0 μ mol/L組第2、3天與第1天比較,增殖明顯受抑,差異無統計學意義(P＞0.05)。另外,相同時間,對照組 與 0.5 μ mol/L 組相 比 、2.0 μ mol/L 組 與 4.0 μ mol/L組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。結果如表1所示(表1中天數為自去藥開始算起)。

表1 MTT法檢測經不同濃度5-aza-CDR激活SYK基因后人胃癌SGC7901細胞的增殖情況

2.2 RT-PCR

空白對照組及0.5 μ mol/L 5-aza-CDR組無 SYK目的基因片段表達;1.0 μ mol/L 5-aza-CDR組及2.0 μ mol/L 5-aza-CDR組有SYK目的基因片段表達,擴增產物大小471 bp。4組均有VEGFmRNA的表達,隨著5-aza-CDR濃度的升高VEGFmRNA的表達量呈遞減趨勢。定量分析結果顯示:各組SYK表達水平與空白對照組比較,0.5 μ mol/L 5-aza-CDR組P＞0.05;1.0 μ mol/L 5-aza-CDR 組 P ＜0.05;2.0 μ mol/L 5-aza-CDR組 P＜0.01.如圖1、表2所示。

圖1 各組人胃癌SGC7901細胞Syk mRNA(左)、VEGFmRNA(右)電泳圖

表2 各濃度5-aza-CDR組與空白對照組人胃癌SGC7901細胞 VEGFmRNA表達水平(OD值)比較

3 討論

本實驗研究證實,去甲基化前的SGC7901細胞中沒有Syk基因的表達,但用5-aza-CDR處理Syk表達陰性的SGC7901細胞后,即能檢測到Syk基因的表達。Syk基因及其表達的作用包括抑制腫瘤的生長和轉移。Olivier B[7]的研究認為,Syk基因的表達產物可通過促進細胞凋亡抑制腫瘤生長;Ganapati H[7]的研究認為Syk蛋白可通過抑制磷脂酰肌醇激酶活性抑制乳腺癌細胞的運動性。近來的研究認為,Syk是內皮細胞生長的重要調控因素,故本實驗利用5-aza-CDR對Syk基因激活的作用,觀察Syk基因的激活對人胃癌SGC7901細胞血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響,從而研究Syk基因的激活對人胃癌SGC7901細胞生長和轉移的影響。研究發現,用5-aza-CDR去甲基化的SGC7901細胞Syk基因表達激活的同時,SGC7901細胞生長增殖明顯受抑,細胞生長增殖受抑制程度在一定藥物濃度范圍內呈現時間、劑量依賴性。SGC-7901細胞VEGFmRNA的表達相應減少,且隨著5-aza-CDR濃度的升高,VEGFmRNA的表達量呈遞減趨勢。因此,抑制VEGFmRNA的表達可能是SYK基因的激活抑制SGC-7901細胞株的生長和轉移的機制之一。除甲基化以外,Syk基因的沉寂有無其它基因及細胞因子的參與,表達缺失的原因等還有待進一步研究。Syk抑制VEGFmRNA的表達以及抑制胃癌的增殖轉移具體作用機制尚不清楚,仍待進一步研究,為防治胃癌癌及其他腫瘤提供新的分子學靶位。

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[2]Coopman PJ,MuellerSC.The Syk tyrosine kinase:a new negative regulator in tumor growth and progression[J].Cancer Lett,2006,241:159.

[3]Katerina Rep ana,Konstantinos Papazisis,et al.Expression of Syk in Invasive Breast Cancer:Correlation to Proliferation and Invasiveness[J].Anticancer Res,2006,26:4949.

[4]Nakashima H,Natsugoe S,Ishigami S,et al.Clinical significance of nuclear expression of spleen tyrosine kinase(Syk)in gastric cancer[J].Cancer Lett,2006,236:89.

[5]Yang Q,shan L,Yoshimura G,et al.5-aza-2-deoxycytidine induces retinoic acid receptor beta 2 demethylation,cell cycle arrest and growth inhibition in breast carcinoma cells[J].Anticancer Res,2002,22:2753.

[6]Larissa Balaian,PhD and Edward D.Ball,MD.5-Azacytidine Potentiates the Anti-Proliferative Activity of Anti-CD33 Monoclonal Antibodies(mAb)in Acute Myeloid Leukemia in Part through Induction of Syk and SHP-1 Expression[J].Blood(ASH Annual Meeting Abstracts),2005;106:2459.

[7]Olivier Bailet,Nina Fenouille,Patricia Abbe,et al.Spleen tyrosine kinase functions as a tumor suppressor in Melanoma Cells by inducing senescence-like growth arrest[J].Cancer Res,2009,69:2748.