銀杏葉提取物對糖尿病大鼠腎臟組織型轉谷氨酰胺酶表達的影響

鄒穎剛,劉 輝,蘇 青,魏海峰,于曉艷*

(1.吉林大學第二醫院,吉林長春130041;2.吉林大學藥學院實驗藥理與毒理教研室;3.吉林大學白求恩醫學院解剖學系;4.長春中醫藥大學附屬醫院病理科)

近年來,有學者將銀杏葉提取物(GBE)應用在糖尿病腎病的實驗研究中,證明其對腎臟功能有明顯保護作用[1,2],但具體機制還不清楚。本文擬探討GBE對糖尿病大鼠腎臟組織型轉谷氨酰胺酶(tTG)的影響,從細胞外基質(ECM)降解角度探討GBE的腎臟保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物 體重200-220 g的雄性Wistar大鼠30只,鼠齡6-8 w,由吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素STZ(Sigma),銀杏葉提取物(2005版)(江蘇徐州華康生物制品有限公司),TRIZOL(Invitrogen公司),逆轉錄酶SuperScriptⅡ(北京Trans Gene公司),TaqDNA聚合酶(北京 Trans Gene公司),PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司),兔抗大鼠tTG多克隆抗體(Sant Cruz公司),SDS-電泳試劑(Sigma)。

1.3 糖尿病(DM)模型的制備 單次腹腔注射STZ(50 mg/kg)誘發糖尿病。

1.4 動物分組 將糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組(DM)10只,銀杏葉提取物組(GBE)10只,另設正常對照組(Control)10只。銀杏葉提取物組(GBE)灌胃銀杏葉提取物100 mg/kg體重/d。正常對照組和糖尿病組僅灌胃給予自來水,連續12 w。于實驗結束前1天收集24 h尿液,雙縮脲法測定尿蛋白濃度。大鼠處死后部分腎臟進行PAS染色,其余-80℃保存備用。

1.5 Western Blot檢測各組大鼠腎臟tTG蛋白表達水平 用凝膠成像及分析系統分析蛋白顯色的灰度值,計算tTG/GAPDH灰度比值。

1.6 RT-PCR檢測各組大鼠腎臟tTG mRNA的表達水平

引物序列GAPDH:上游:5'-ACCACAGTCCATGC-CATCAC-3',下游:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',擴增片段長度為452 bp;tTG:上游:5'-GGCAATGACTTTGACGTGTTTG-3';下游:5'-ATACAGGGAATCAGAAAGTGGGTTC-3',擴增片段長度為396 bp。以GAPDH校正作相對量分析,應用計算機圖像分析系統測算tTG/GAPDH灰度比值。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組血糖、尿白蛋白比較 與正常對照組比較,DM 組血糖(22.19±2.50 mmol/L)、24 h尿白蛋白排泄量(355.78±20.34 μ g/24 h)明顯升高 ,說明動物已出現明顯腎臟功能改變。與DM組比較,GBE組大鼠24 h尿蛋白排泄量(301.58±28.63 μ g/24 h)明顯減少(P＜0.05),血糖(20.02±4.96 mmol/L)無明顯變化。

2.2 PAS染色光鏡觀察 對照組腎小球、腎小管形態正常,DM組腎小球系膜細胞增生,PAS陽性物質明顯增多,GBE組系膜細胞增生較糖尿病組減輕,系膜區PAS陽性物質明顯減少(見圖1)。

圖1 各組大鼠腎臟PAS染色

2.3 Western Blot檢測各組大鼠腎臟tTG蛋白表達水平

圖2 各組大鼠腎臟tTG蛋白表達

由圖2分析腎臟皮質Western Blot的檢測結果,tTG在正常組織中表達較少(0.21±0.12),在糖尿病腎臟中表達明顯增加(0.47±0.18,P＜0.01),在GBE組中tTG的表達(0.29±0.07)與DM組比較明顯降低(P＜0.01)。

2.4 RT-PCR檢測各組大鼠腎臟tTG mRNA的表達水平

由圖3分析tTG mRNA在DM組大鼠腎臟中的表達(3.01±0.42)與對照組(1.35±1.02)相比顯著增加(P＜0.01),GBE組(2.21±1.14)tTG mRNA的表達與DM組相比明顯下降(P＜0.05)。

圖3 各組大鼠腎臟mRNA表達

3 討論

以往臨床研究發現經銀杏葉治療的DN患者尿白蛋白顯著降低,腎臟結構特別是濾過膜病變明顯減輕,在基礎研究中同樣發現銀杏葉對糖尿病大鼠腎結構功能具有保護作用。本試驗中我們也得到了相同的結果,給予GBE的糖尿病大鼠尿蛋白排泄率明顯降低,PAS染色顯示ECM(PAS染色陽性物質)較糖尿病組含量減少。

GBE可通過多種機制實現腎臟保護作用,如抗自由基損傷、抑制脂質過氧化的形成,保護細胞膜不受自由基損害,提高抗氧化能活性[3,4]等。本試驗僅從ECM積聚角度討論。ECM積聚是糖尿病腎病最基本的病理變化。合成增加和降解減少都可導致ECM積聚,而降解酶系統(纖溶系統和基質金屬蛋白酶系統)被抑制、tTG表達和活性增加均可引起降解減少。侯淑芬等人的研究表明GBE可調節腎臟內基質金屬蛋白酶系統中MMP-9、TIMP-1、織纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)以及Ⅳ型膠原mRNA的表達從而減輕腎小球ECM積聚[1.2]。而GBE對糖尿病腎臟tTG的影響此前尚無報導。在我們的實驗結果中發現無論是蛋白水平,還是mRNA水平,GBE均能降低糖尿病大鼠tTG的表達,并且與ECM量(PAS陽性物質)趨勢相同,表明GBE可通過降低tTG的表達緩解ECM積聚。結合其他研究學者的研究結果,可以推斷GBE對ECM積聚多種途徑(ECM合成、降解酶系及調節ECM抵抗蛋白降解酶的水解作用)均有影響。

總之,我們此次研究結果表明糖尿病狀態下,tTG活性下降是GBE腎臟保護作用的機制之一。

[1]侯淑芬,張海松,劉占全,等.銀杏黃酮苷對糖尿病大鼠腎組織病理變化的影響[J].中國誤診學雜志,2005,5(6):1012.

[2]陳三妹,李 紅,王 芳,等.銀杏葉提取物對2型糖尿病大鼠腎臟結構和功能的影響[J].中國病理生理雜志,2006,22(8):1654.

[3]廖 璞,王淑琴,廖雪松,等.銀杏葉提取物對糖尿病大鼠腎臟保護作用的實驗研究[J].中國藥房,2000,11(3):114.

[4]Coskun O,Ar mutcu F,Kanter M,et al.Protection of endotoxin-induced oxidative renal tissue damage of rats by vitamin E or/and EGb 761 treatment[J].J Appl Toxicol,2005,25(1):8.