NirB啟動子調(diào)控下鼠沙門氏菌體內(nèi)誘導(dǎo)型表達(dá)載體的構(gòu)建

郭 恒,王學(xué)林,李慧萍,劉 學(xué),張凌怡,唐藝芝,高 鶴,楊秀麗,徐德啟,3,劉明遠(yuǎn)*,王光明*

(1.吉林大學(xué)人獸共患病研究所,吉林長春130062;2.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科;3.美國食品與藥品管理局(FDA),美國馬里蘭20892)

減毒沙門氏菌是細(xì)胞內(nèi)致病菌,可通過腸道黏膜侵入黏膜相關(guān)淋巴組織,被抗原提呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞攝取,并在其中增殖。由于其感染的細(xì)胞靶向性,減毒沙門氏菌作為口服疫苗載體具有很好的發(fā)展?jié)摿?可在多種哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)出體液、細(xì)胞及黏膜免疫應(yīng)答[1-3]。由于外源基因表達(dá)的蛋白對沙門氏菌可能具有毒性作用,在缺乏選擇條件的體內(nèi)環(huán)境中,菌體內(nèi)的外源質(zhì)粒可逐漸丟失,因此構(gòu)建營養(yǎng)缺陷系統(tǒng)、染色體整合、使用體內(nèi)激活的啟動子等已成為改進(jìn)減毒沙門氏菌載體的關(guān)鍵。體內(nèi)激活啟動子轉(zhuǎn)錄活性極低,而在被攝入的宿主細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá),故這種宿主體內(nèi)激活的啟動子不僅可減少表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)菌的毒性,而且也有助于防止重組質(zhì)粒的丟失[4,5]。

本研究從鼠沙門氏菌基因組DNA中克隆出PnirB啟動子,以綠色熒光蛋白(EGFP)為報告基因,構(gòu)建一個遺傳穩(wěn)定性好、蛋白表達(dá)量高的沙門氏菌體內(nèi)誘導(dǎo)型表達(dá)載體,為以減毒沙門菌為活載體的安全、有效、廉價的新型“暴露前”口服疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鼠沙門氏菌PhoP/PhoQ株(簡稱S.PQ株),大腸埃希菌(E.coli)JM109,載體質(zhì)粒 pGB2、pkk233-2、pEGFP-N1由本實驗室保存。核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ,T4 DNA連接酶,DNA凝膠回收試劑盒購自MBI公司,Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T simple載體、DNA Marker(DL2000)購自TaKaRa公司,細(xì)菌基因組DNA小量抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自V-gene公司。

1.2 目的片段的擴增

以S.PQ株基因組:pEGFP-N1、Pkk233-2載體質(zhì)粒為模板,分別擴增PnirB、EGFP和 rrnbT1T2轉(zhuǎn)錄終止序列。純化回收的PCR產(chǎn)物連至pMD18-T simple載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。PCR和雙酶切鑒定正確后送Sangon公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為18TPnirB、18T-EGFP、18T-rrnb。具體引物序列如表1:

表1 擴增用引物序列

1.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將構(gòu)建的18T-PnirB、18T-EGFP、18T-rrnb質(zhì)粒分別用HindⅢ/BamHⅠ 、BamHⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切,回收目的片段。回收后的片段與HindⅢ/EcoRⅠ酶切的pGB2載體片段22℃在T4 DNA連接酶作用下連接2 h,轉(zhuǎn)化至宿主菌JM109中。重組菌質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定正確后命名為pGnirB-EGFP-rrnb。

1.4 減毒鼠沙門氏菌的電穿孔轉(zhuǎn)化

按Sanderson KE等[6]的方法制備S.PQ感受態(tài)細(xì)菌,分別加入 1 μ g pGnirB-EGFP-rrnb和 pGB2質(zhì)粒,混勻后冰浴15 min并移入1 mm電轉(zhuǎn)杯中。電轉(zhuǎn)儀經(jīng)預(yù)熱后,C=25 μ F 、PC=200 ohm、V=1.25 kV參數(shù)下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化操作。電擊結(jié)束后迅速加入1 ml液體LB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)1 h。取 300 μ l菌液涂布于含 50 μ g/ml壯觀霉素(spectinomycin,SPC)的LB固體培養(yǎng)基平皿上,于37℃培養(yǎng)12-16 h。重組菌經(jīng) PCR鑒定正確后命名為S.PQ-EGFP、S.PQ-pGB2。

1.5 S.PQ-EGFP重組菌中質(zhì)粒的體外遺傳穩(wěn)定性試驗

參考Xu DQ等[7]的方法在無抗生素選擇壓力下用連續(xù)傳代法鑒定質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化菌中的遺傳穩(wěn)定性。挑取S.PQ-EGFP單菌落,接種到5 mL LB培養(yǎng)基中,37℃,空氣浴振蕩培養(yǎng)12-16 h,將重組菌梯度稀釋至約100 CFU/ml,在無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12 i(約25代),同法獲得第50、75、100代的細(xì)菌。將不同代次的重組菌稀釋后涂于無抗生素的瓊脂板上,37℃倒置培養(yǎng)12 h,每個板隨機挑取20個單菌落進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 EGFP表達(dá)的檢測

將5 ml S.PQ-EGFP和S.PQ-pGB2重組菌37℃空氣浴振蕩培養(yǎng)至OD值約0.5,用無菌液體石蠟封閉液面,37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h。離心收集重組菌,0.01×PBS洗3遍后取適量菌涂布于載玻片上于激光共聚焦顯微鏡(10×,200×)下觀察。

2 結(jié)果

2.1 基因的克隆、鑒定及序列分析

擴增的PnirB、EGFP和rrnbT1T2片段電泳結(jié)果顯示分別獲得與理論值大小相符的特異目的條帶(圖1)。雙酶切相應(yīng)的連于T載體的質(zhì)粒,電泳后出現(xiàn)與目的片段大小一致的特異帶(圖2)。測序表明擴增的EGFP和rrnb和PnirB片段GenBank中序列完全一致。

圖1 PnirB、EGFP、rrnbT1T2片段的 PCR擴增

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

按低拷貝質(zhì)粒提取說明書提取構(gòu)建的重組菌質(zhì)粒,用 GFP-1 和 GFP-2、NirB-1 和 GFP-2、NirB-1和rrnb-2引物進(jìn)行PCR驗證,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示分別擴增出約750 bp、1 000 bp和1 400 bp的片段,大小與理論值相符(圖3)。BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒,電泳顯示插入的基因片段與理論大小相符(圖4)。重組質(zhì)粒于Sangon公司以引物NirB-1和rrnb-2測序,結(jié)果表明插入到pGB2載體上的三個片段均無突變錯誤,而且未出現(xiàn)移碼,該表達(dá)載體可應(yīng)用于后續(xù)實驗。

2.3 S.PQ-EGFP中質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性檢測

S.PQ-EGFP在無抗生素的情況下連續(xù)傳代培養(yǎng),長勢良好,每25代隨機挑取20個單菌落進(jìn)行PCR,重復(fù)兩次,只一組的第100代次出現(xiàn)一個陰性結(jié)果,表明重組質(zhì)粒在菌中未丟失,遺傳穩(wěn)定性高于95%。

2.4 EGFP在沙門氏菌中的表達(dá)

重組菌厭氧靜置培養(yǎng)72 h后,表達(dá)菌細(xì)胞涂布于載玻片上,激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)S.PQEGFP組菌體有綠色熒光出現(xiàn),而對照組無綠色熒光,說明PnirB調(diào)控下的沙門氏菌體內(nèi)誘導(dǎo)型表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖5)。

圖 2 18T-EGFP、rrnb、PnirB質(zhì)粒的酶切圖

圖3 重組表達(dá)載體的PCR鑒定

圖4 重組表達(dá)載體的酶切鑒定

圖5 重組菌表達(dá)的熒光檢測(10×,200×)

3 討論

本實驗選用了含pSC101復(fù)制子的低拷貝(5-7個/cell)pGB2載體為骨架。pSC101復(fù)制子中含有具有分配功能的DNA片段即par區(qū)(410 bp),par區(qū)不含有轉(zhuǎn)錄或翻譯的起始信號,可專一性地負(fù)責(zé)質(zhì)粒的分配和穩(wěn)定的維持。研究顯示[8],貫穿啟動子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動子的功能,造成所謂的啟動子封堵。由此本實驗在構(gòu)建的pGB2-EGFP載體的多克隆位點的下游加入了來自大腸桿菌rrnB操縱元的兩個終止子T1和T2串聯(lián)的強轉(zhuǎn)錄終止序列rrnbTlT2。雖然轉(zhuǎn)錄終止子在表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程中常被忽略,但有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達(dá)載體必不可少的元件。轉(zhuǎn)錄終止子的出現(xiàn)將增強mRNA的穩(wěn)定性,并最大限度地減小背景的轉(zhuǎn)錄。體外遺傳穩(wěn)定性研究顯示,本試驗構(gòu)建的表達(dá)載體無抗生素下培養(yǎng)24 h后穩(wěn)定性達(dá)95%以上,明顯高于使用PGB2載體構(gòu)建的炭疽保護(hù)性抗原表達(dá)系統(tǒng)(73%)無終止序列[9],這種差異的原因尚需進(jìn)一步的實驗研究。

由于目前尚無商品化的含有nirB啟動子的表達(dá)載體,本文使用常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建了低拷貝的體內(nèi)誘導(dǎo)型表達(dá)載體。通過報告基因EGFP的使用實現(xiàn)了對重組載體在沙門菌中表達(dá)蛋白能力的方便、快速、直觀的檢測。本實驗的完成為以減毒沙門菌為活載體的安全、有效、廉價的新型“暴露前”口服疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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