海參腸自溶水解物抗氧化活性的研究

鄭 杰， 吳 海 濤， 朱 蓓 薇,， 董 秀 萍,

( 1.江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

抗氧化活性肽是具有抑制生物大分子過(guò)氧化或清除體內(nèi)自由基功效的生物活性肽[1]，是被廣泛研究的一類(lèi)活性肽，尤其是從水產(chǎn)動(dòng)物中制備天然抗氧化肽替代化學(xué)合成抗氧化劑已經(jīng)越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注。一般認(rèn)為，肽的抗氧化作用與其氨基酸組成、氨基酸序列和空間構(gòu)象有關(guān)[2]。目前，研究學(xué)者已經(jīng)從鰱魚(yú)[3]、金槍魚(yú)[4]、海灣扇貝[5]和蝦[6]等多種水產(chǎn)動(dòng)物中制備得到抗氧化活性肽。海參因其蛋白質(zhì)含量極高也成為抗氧化活性肽的良好來(lái)源。

水產(chǎn)品抗氧化活性肽的制備方法主要有蛋白酶水解法和微生物發(fā)酵法兩種[7]，也有研究人員通過(guò)自溶手段制備得到具有抗氧化活性的魚(yú)肉蛋白水解物[8]。海參(Stichopusjaponicus)具有極強(qiáng)的自溶能力，在紫外線(xiàn)照射下可誘導(dǎo)自溶的快速發(fā)生[9]。本研究以海參加工過(guò)程中的廢棄物——海參腸為原料，利用紫外線(xiàn)照射誘導(dǎo)其自溶，制備海參腸自溶水解物，并研究其分子質(zhì)量分布、氨基酸組成和體外抗氧化作用，旨在為海參腸的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，并進(jìn)一步豐富海參自溶理論。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

原料：成年鮮活海參，購(gòu)于大連市長(zhǎng)興水產(chǎn)品市場(chǎng)。海參在低溫條件下運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，立即殺死，取腸清洗后于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH ·,C18H12N5O6)，N-Hippuryl-His-Leu(0.43 ku)和Vitamin B12(1.355 ku)，Sigma公司；Cytochrome C(12.5 ku)，Aprotinin(6.512 ku)，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；18肽(2.342 ku)，西安聯(lián)美生物科技有限公司；所用其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

LG-1.0型真空冷凍干燥機(jī)，沈陽(yáng)新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；BIO-RAD 680酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD公司；Z323K型冷凍離心機(jī)，HERMLE，GERMANY；JJ 200Y型精密電子天平，美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 海參腸自溶水解物的制備

海參腸自溶水解物的制備建立在前期研究工作[10]的基礎(chǔ)上。新鮮海參腸，打漿，紫外線(xiàn)(30 W，0.5 m)照射30 min后，加入3倍體積的McIIvaine’s緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 4.4)，于48 ℃自溶4 h，13 500 r/min離心10 min，取上清液，冷凍干燥后即為自溶水解物樣品，于低溫、干燥條件下貯存?zhèn)溆谩＝?jīng)測(cè)定，自溶水解物中主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)、糖和脂肪，分別占干物質(zhì)(去除無(wú)機(jī)鹽)的63.70 %、14.23 %和2.21%。

1.3.2 分子質(zhì)量分布范圍的測(cè)定

海參腸自溶水解物分子質(zhì)量的分布范圍采用依利特P230高效液相色譜(依利特，中國(guó))匹配Superdex Peptide 10/300 GL(10 mm× 300 mm)凝膠過(guò)濾柱(通用電器醫(yī)療集團(tuán)，美國(guó))測(cè)定。進(jìn)樣量：50 μL；進(jìn)樣質(zhì)量濃度：5 mg/mL；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.15 mol/L NaCl，pH 7.0)；洗脫流量：0.5 mL/min。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用Cytochrome C(12.5 ku)，Aprotinin(6.512 ku)，18肽(2.342 ku)，Vitamin B12(1.355 ku)和N-Hippuryl-His-Leu(0.43 ku)。對(duì)凝膠過(guò)濾色譜而言，分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(y)與保留時(shí)間(x)呈線(xiàn)性關(guān)系，經(jīng)過(guò)計(jì)算所得分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=-0.083 4x+5.755 4(R2=0.994 4)。

1.3.3 氨基酸組成分析

樣品由國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心采用HPLC法進(jìn)行氨基酸組成分析。

1.3.4 DPPH ·清除能力的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[11]所述方法，1 mL不同濃度樣品溶液與2 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.0)以及2 mL DPPH溶液(200 μmol/L，溶于95%乙醇)混合，漩渦振蕩后，室溫避光保存30 min。在2 000g離心10 min后，取上清液在517 nm下測(cè)其吸光值。DPPH ·清除率計(jì)算如下：

(1)

式(1)中，As為樣品吸光值測(cè)定值；A0為以95%乙醇代替DPPH溶液時(shí)測(cè)定的吸光值；A為以去離子水代替樣品時(shí)的空白測(cè)定值。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5 Fe2+螯合能力的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[12]所述方法，1 mL不同濃度樣品溶液，與50 μL氯化亞鐵溶液(2 mmol/L)和1 mL去離子水混合均勻后室溫靜置5 min，再加入100 μL菲咯嗪溶液(5 mmol/L)，混勻后室溫靜置5 min，反應(yīng)結(jié)束后，在2 000g條件下離心10 min，取上清液測(cè)其在562 nm下吸光值。Fe2+螯合率計(jì)算如下：

(2)

式(2)中，As為樣品測(cè)定值；A為用等體積去離子水代替樣品后的測(cè)定值。以EDTA-2Na作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6 還原能力的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[13]所述方法，1 mL不同濃度樣品溶液與1 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)以及2 mL鐵氰化鉀溶液(質(zhì)量濃度為10 mg/mL)混合，漩渦振蕩，50 ℃水浴加熱20 min后加入1 mL三氯乙酸溶液(質(zhì)量濃度為100 mg/mL)終止反應(yīng)。混勻后，2 000g離心10 min，取2 mL上清液，并加入2.5 mL去離子水和0.3 mL三氯化鐵溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，室溫靜置10 min后，在700 nm下測(cè)定吸光值，吸光值越高則表示還原能力越強(qiáng)，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參腸自溶水解物分子質(zhì)量分布

海參腸自溶后，蛋白質(zhì)發(fā)生顯著降解。采用Superdex Peptide 10/300 GL凝膠過(guò)濾色譜柱對(duì)海參腸自溶水解物的分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。海參腸自溶水解物主要由分子質(zhì)量在3 ku以下的組分組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到87.7%)，而其中又以分子質(zhì)量在1 ku以下的組分為主體。

圖1 海參腸自溶水解物的HPLC譜圖

2.2 海參腸自溶水解物的氨基酸組成

分析海參腸自溶水解物的氨基酸組成，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，海參腸自溶水解物含有17種氨基酸，包括除色氨酸之外的所有種類(lèi)的必需氨基酸。此外，還含有較多與抗氧化活性密切相關(guān)的氨基酸，如Ala、Val和Leu等。海參腸自溶水解物中必需氨基酸占總氨基酸的27.2%。Glu和Gly的含量相對(duì)較高。

表1 海參腸自溶水解物的氨基酸組成

2.3 海參腸自溶水解物的抗氧化活性

目前報(bào)道的水產(chǎn)品抗氧化肽中，分子質(zhì)量多低于3 ku，主要集中在1 ku左右，其氨基酸殘基的數(shù)目一般在20個(gè)以?xún)?nèi)[7]。氨基酸組成與肽的抗氧化性密切相關(guān)[14]，如富含His、Ala、Val、Met和Leu的肽普遍具有較高的抗氧化活性[15]。從分子質(zhì)量分布范圍和氨基酸組成兩方面來(lái)看，海參腸自溶水解物具有潛在的抗氧化活性，因此進(jìn)一步對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，包括對(duì)DPPH ·的清除能力、金屬離子螯合能力以及還原能力。

2.3.1 海參腸自溶水解物對(duì)DPPH ·的清除能力

DPPH ·是一種脂溶性的自由基，從抗氧化劑中獲得一個(gè)電子后可形成一個(gè)穩(wěn)定的分子[16-17]。與大多數(shù)自由基不同的是，它能在室溫條件下保持穩(wěn)定[18]。用分光光度法進(jìn)行定量分析即可評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。由圖2可知，海參腸自溶水解物具有一定的DPPH ·清除能力，且清除能力與樣品濃度之間存在明顯的量效關(guān)系，其SC50(DPPH ·清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度，S-Scavenging)為4.04 mg/mL，明顯弱于對(duì)照VC。海參腸自溶水解物對(duì)DPPH ·的清除能力弱于劉程惠等[19]通過(guò)胰蛋白酶酶解所制得的1～3 ku的海參肽[IC50為(1.27±0.09)mg/mL]，接近于大馬哈魚(yú)魚(yú)精蛋白水解物[20]，明顯強(qiáng)于軍曹魚(yú)魚(yú)皮明膠水解物[21]。

圖2 海參腸自溶水解物對(duì)DPPH ·的清除能力

2.3.2 海參腸自溶水解物的Fe2+螯合能力

有機(jī)體內(nèi)的許多氧化反應(yīng)都與金屬離子的轉(zhuǎn)變有關(guān)，金屬離子螯合能力是評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除能力的一個(gè)重要指標(biāo)。海參腸自溶水解物的Fe2+螯合能力采用菲咯嗪法進(jìn)行測(cè)定。菲咯嗪可與Fe2+結(jié)合形成紅色絡(luò)合物，當(dāng)反應(yīng)體系中有金屬離子螯合劑存在時(shí)，此絡(luò)合物便會(huì)分解，紅色消失。因此，根據(jù)體系顏色的變化即可測(cè)定樣品的螯合能力[22]。由圖3可知，海參腸自溶水解物對(duì)Fe2+有一定的螯合能力，且其螯合能力的強(qiáng)弱與樣品濃度呈正相關(guān)，其CC50(螯合率達(dá)到50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度，C-Chelating)為5.91 mg/mL。海參腸自溶水解物的螯合能力雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于陽(yáng)性對(duì)照EDTA-2Na，但卻接近或強(qiáng)于太平洋鱈魚(yú)肉水解物[8]、鰱魚(yú)風(fēng)味蛋白酶酶解物[23]及魷魚(yú)明膠[24]。

圖3 海參腸自溶水解物的Fe2+螯合能力

2.3.3 海參腸自溶水解物的還原能力

在還原能力測(cè)定中，反應(yīng)物在700 nm處的吸光值越大表示還原能力越強(qiáng)。一般情況下，生物活性化合物的還原能力與其抗氧化能力呈正相關(guān)[25-26]，還原能力越強(qiáng)，表明抗氧化能力越強(qiáng)。圖4顯示，海參腸自溶水解物的還原能力均與其濃度呈正相關(guān)，即隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，還原能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為13.20 mg/mL時(shí)，反應(yīng)物在700 nm處的吸光值可達(dá)到0.72。將A700為0.5時(shí)的樣品濃度定義為AC0.5，結(jié)果顯示，海參腸自溶水解物的AC0.5為8.06 mg/mL，這說(shuō)明海參腸自溶水解物具有一定的還原能力，遠(yuǎn)強(qiáng)于海蜇蛋白[27]，但明顯弱于對(duì)照VC。

3 結(jié) 論

海參腸自溶水解物主要由分子質(zhì)量小于3 ku的組分組成，含有17種氨基酸。海參腸自溶水解物具有一定的DPPH ·清除能力、Fe2+螯合能力和還原能力，其SC50、CC50和AC0.5分別為4.04、5.91和8.06 mg/mL。

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