牡蠣糖原的提取、純化及補體活性研究

宋 蓀 陽, 朱 蓓 薇, 楊 靜 峰, 孫 黎 明

( 1.大連工業大學 海洋食品教育部工程研究中心, 遼寧 大連 116034; 2.大連工業大學 農業部農產品加工技術研發貝類專業分中心, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

牡蠣是一種營養價值很高的海珍品[1]。牡蠣蛋白質中氨基酸組成完善,富含鐵、鋅、鈣、錳、硒等微量元素[2]。近年來,牡蠣的生理活性得到廣泛的關注。已有研究報道表明牡蠣酶解液具有較好的抗氧化活性[3],牡蠣提取物對小鼠肝臟具有保護作用[4],牡蠣糖氨聚糖具有抗腫瘤活性[5]等。其中關于牡蠣多糖的相關研究較多。證明了牡蠣多糖在抗凝血、降血脂[6]、提高免疫功能[7]等方面均具有較好的活性。

糖原是一種僅有葡萄糖組成的特殊多糖,是動物體內能源物質的貯存形式。由于其獨特的分子結構,使其在生理活性上不同于一般多糖。陳騫等研究表明,牡蠣糖原具有較好的抗疲勞活性[8],并且證明其相對分子質量在數百萬到數千萬之間[9]。目前關于牡蠣糖原及其活性的研究報道尚不多見,因此對其生理活性物質的研究具有重要意義。本文采用酶法結合醇沉制備了牡蠣糖原,并通過柱層析分離技術得到純度較高的牡蠣糖原組分,對牡蠣糖原的體外補體活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮牡蠣,購于大連市春柳市場；胃蛋白酶,杭州中香化學有限公司；木瓜蛋白酶,上海生工生物工程技術服務有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

LG-1.0型真空冷凍干燥機,沈陽航天新陽速凍設備制造有限公司；UV-2100紫外分光光度計,尤尼柯儀器有限公司；Agilent 6890N型氣相色譜儀,美國Agilent公司；BIO-RAD 680酶標儀,美國BIO-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣粗糖原的制備

將新鮮牡蠣去殼,真空冷凍干燥機中干燥,粉碎,過20目篩,備用。

稱取牡蠣干粉,加入45倍體積水攪拌均勻,以6 mol/L NaOH調pH至2.0,加入質量分數1.5%的胃蛋白酶,37 ℃水解2 h,迅速滅酶10 min,冷卻至室溫后,以6 mol/L HCl調pH至中性,4 000 r/min離心10 min,取上清,加入3倍體積95%乙醇,醇沉12 h,棄去酒精,取沉淀,加水復溶,離心至無沉淀或少沉淀,收集上清液,濃縮、凍干,即得牡蠣粗糖原(crude oyster glycogen,COG)。于COG中,加入木瓜蛋白酶進行二次酶解。酶解條件如下：料液比1∶45,酶加量為底物質量的1.5%,在pH 7.0、溫度為65 ℃條件下,酶解3 h。酶解后醇沉12 h,收集沉淀加水復溶,離心至無沉淀或少沉淀,收集上清液,濃縮,凍干,即得牡蠣糖原。

1.3.2 牡蠣糖原的分離純化

首先采用陰離子交換柱DEAE-cellulose 52(2.0 cm×40 cm)對OG進行分離純化,上樣質量濃度為50 mg/mL,上樣量為2 mL。分別用0、0.15和0.5 mol/L NaCl作為洗脫液進行梯度洗脫。體積流量為1 mL/min,每6 min收集一管。采用苯酚-硫酸法檢測糖原組分。將收集到的各組分合并、濃縮、透析(流水透析24 h,去離子水透析24 h)、凍干,即得組分OG1,OG2,OG3。對組分OG1,進一步采用葡聚糖凝膠Sephadex G-100進行分離純化(1.6 cm×80 cm),0.15 mol/L NaCl進行線性洗脫,體積流量為每12 min 2 mL,每2 mL收集一管。采用苯酚硫酸法檢測糖原質量分數,得到純化后糖原OG11。

1.3.3 牡蠣糖原的組分分析

糖原質量分數測定采用苯酚硫酸法[10],蛋白質質量分數測定采用Folin-酚法[11]。

1.3.4 牡蠣糖原純度鑒定

將Sephadex G-100分離純化后的OG11采用高效液相色譜進行純度鑒定。進樣量為20 μL。色譜分析采用島津公司的SCL-10AVP高效液相色譜儀,分析條件如下：色譜柱為TSK-GEL G4000PWXL柱(7.8 mm×300 mm),流動相為超純水；體積流量為0.5 mL/min。將收集到的樣品采用苯酚硫酸法檢測。

1.3.5 牡蠣糖原單糖組成鑒定

牡蠣糖原的單糖組成鑒定采用氣相色譜法[12]。

稱取5 mg樣品,向其中加入1.0 mL 2 mol/L 的三氟乙酸(TFA),在120 ℃條件下水解2 h后移入蒸發皿中,于80 ℃水浴中加無水乙醇除酸。待中性后,在溶液中加入1.0 mg 肌醇及1.0 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液,在30 ℃水浴下保溫50 min后向溶液中加入50 mg硼氫化鈉,室溫下靜置1.5 h后用25%乙酸中和溶液,采用陽離子交換樹脂除鹽、過濾、蒸餾水洗滌并移入水解管中干燥。向水解管中加入1.0 mL甲醇除酸,N2吹干,重復2次。向水解管中加入1.0 mL正丙胺、1.0 mL吡啶、0.5 mL乙酸酐、90 ℃保溫1 h,N2吹干后加入0.5 mL無水二氯甲烷,待沉淀溶解后離心,取上清,待測。

氣相色譜條件：色譜柱,AJW&HP-88 Capillary column(100 m×250 μm×0.25 μm)(Agilent,美國)；程序升溫,180 ℃保持3 min；以10 ℃/min的速度升至230 ℃,保持20 min；以5 ℃/min的速度升至240 ℃,保持20 min；以5 ℃/min的速度升至250 ℃,保持30 min；載氣(N2)體積流量0.5 mL/min；壓力171.8 kPa；進樣量為5 μL。

1.3.6 牡蠣糖原補體活性的研究

首先制備致敏綿羊紅細胞。取綿羊紅細胞用緩沖液離心洗3次,每次2 000 r/min,離心10 min,重復3次。再用GGVB配制成體積分數為2%的綿陽紅細胞(SRBC)懸液。取相同體積2 U溶血素加入SRBC懸液中,混勻后置37 ℃水浴致敏30 min,即為致敏的綿羊紅細胞懸液。樣品檢測時,取100 μL樣品,200 μL補體(人血清,1∶25稀釋),200 μL GGVB(0.141 mol/L NaCl,0.5 mmol/L MgCl2,0.15 mmol/L CaCl2,1.8 mmol/L巴比妥鈉,0.1%明膠,pH 7.4),37 ℃水浴30 min,加入100 μL致敏綿羊紅細胞,37 ℃水浴30 min,4 000 r/min離心10 min,取上清液在405 nm處測吸光值。設空白對照,用100 μL GGVB代替樣品。

2 結果與討論

2.1 牡蠣糖原的提取及組分分析

動物體內多糖多與蛋白質以共價結合形式存在,采用傳統的水提法很難將其去除。本實驗采用蛋白酶酶解去除牡蠣中的蛋白質。

表1顯示,牡蠣干粉經胃蛋白酶一次酶解后糖質量分數達到72.58%,說明使用胃蛋白酶并結合乙醇沉淀能有效提取COG,但是仍有12.30%的蛋白質未被去除,因此采用二次酶解,加入木瓜蛋白酶去除這部分蛋白質,得到OG。木瓜蛋白酶酶解后蛋白質量分數僅為1.81%,同時糖質量分數也得到顯著提高。

表1 牡蠣糖原組成

2.2 牡蠣糖原的分離純化

采用陰離子交換柱DEAE-52對OG進行分離純化。經不同濃度的NaCl進行梯度洗脫后,得到3個帶不同電荷的組分OG1、OG2和OG3(圖1)。由表1可知,OG1糖質量分數極高且幾乎不含蛋白質,為牡蠣糖原的主要組分。因此,將其作為主要研究對象,采用葡聚糖凝膠Sephadex G-100進一步分離純化,得到3個分子質量不同的糖峰：OG11、OG12、OG13(圖2)。其中OG11峰值明顯高于其他組分,因此該組分為牡蠣糖原的主要組成成分。圖2結果還表明牡蠣糖原的分子質量較大,這與文獻[9]報道一致。

圖1 OG DEAE-52分離純化

圖2 OG1 Sephadex G-100 分離純化

2.3 牡蠣糖原純度的鑒定

采用高效液相色譜法對分離純化后的組分OG11進行純度鑒定。樣品采用苯酚硫酸法進行檢測,僅得到一個單一峰,且對稱性較好(圖3),證明得到純度較高的牡蠣糖原組分。

圖3 OG11高效液相色譜純度鑒定

2.4 牡蠣糖原的鑒定

將OG11組分進行單糖組成鑒定(圖4)。通過氣相色譜法,樣品經三氟乙酸水解,采用乙?；椒▽悠愤M行處理,肌醇為內標。標準單糖采用相同的處理方法。OG11氣相色譜結果顯示,牡蠣中僅含一種單糖組分,以此組分的相對保留時間與標準單糖出峰的相對保留時間進行對照,證明該單糖組分為葡萄糖。

圖4 牡蠣糖原氣相色譜圖

2.5 牡蠣糖原補體活性的研究

OG11在質量濃度為0.1～5.0 mg/mL,補體抑制活性由8.09% 提高到77.38%(圖5),且具有一定的劑量-效應關系。

補體系統是人體重要的免疫防御系統之一。補體系統過度激活會引起人體免疫系統的過度反應,造成人體自身正常組織的損傷。

多糖是一類具有顯著抗補體活性的天然產物[13]。國內外研究表明,多糖的抗補體活性主要與其單糖組成、硫酸基團及支鏈結構的存在有關[14-16]。陳騫等[17]對牡蠣糖原結構的研究發現,其鏈長較短且分支化程度高。這有可能與牡蠣的補體活性有關,具體機理還有待于進一步研究。

圖5 牡蠣糖原對補體活性的抑制作用

Fig.5 The anti-complementary activity of oyster glycogen

3 結 論

(1)胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理,可以有效除去蛋白,使COG中的蛋白質量分數從12.30%降低至1.81%(OG)。通過DEAE-52和Sephadex G-100的純化作用可進一步降低糖原中的蛋白,組分OG1的蛋白質量分數僅為0.33%。

(2)OG11對補體的經典途徑具有較強的抑制作用。

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