熱水法抽提鱈魚皮膠原蛋白條件的響應面分析

趙 睿， 王 曉 丹， 祖 國 仁， 趙 長 新

( 大連工業大學 生物工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

膠原蛋白是動物體最重要的蛋白質之一，是結締組織極重要的結構蛋白質[1]。我國在水產市場上存在大量鱈魚皮，而鱈魚皮中存在大量的膠原蛋白。關于鱈魚皮中膠原蛋白的提取方法在之前的研究中未見報道，如果能從這些廢棄的鱈魚皮中提取膠原蛋白加以利用，可減少環境污染，獲得更安全的膠原蛋白[2]。

在以往的研究中，膠原蛋白的提取方法主要是酸提取法和酶提取法[3]。但酸法對膠原的損傷嚴重，難以獲得較高質量的產品；而酶法引入外源蛋白，會對膠原蛋白的提純造成影響。本文采用過程簡單、便于操作的熱水抽提法[4]，以鱈魚加工的廢棄物魚皮作為研究材料，考查不同的水解溫度、pH及水解時間對膠原蛋白提取率的影響，為我國水產品加工業的下腳料以及皮革行業產生的大量廢棄物的利用和開發提供了綠色化工的有效途徑，找出了較為經濟的水解方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

鱈魚皮，購于大連市場；正己烷、0.2%NaOH溶液、0.2%硫酸、檸檬酸、pH試紙、硝酸銀溶液等試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

JM-250小型電泳儀，大連捷邁科貿有限公司；KDN-05A蛋白質測定儀，上海貝特儀電設備廠；GTL-16A高速離心機，上海浦東物理光學儀器廠。

1.3 方 法

1.3.1 膠原蛋白的提取

1.3.1.1 魚皮的預處理

將魚皮去除魚鱗魚肉，洗凈風干后，剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，放入冰箱備用。

去脂肪：魚皮中加入其質量30倍的20%的正己烷溶液(料液比1∶30)，加入表面活性劑于4 ℃下攪拌浸泡24 h，然后用蒸餾水反復清洗。

去雜蛋白：用0.2%的NaOH浸泡魚皮40 min，攪拌，去離子水清洗至pH為中性；然后用0.2%的硫酸浸泡魚皮40 min，攪拌，去離子水清洗至pH為中性；最后用1%的檸檬酸浸泡魚皮40 min，攪拌，去離子水清洗至pH為中性。

1.3.1.2 熱水法提取膠原蛋白

將2 g左右的魚皮放入燒杯中，按料液比為1∶100加入去離子水，設置溫度，用磁力攪拌器邊攪拌邊加熱保溫。隨著時間的延長，魚皮中的膠原蛋白，慢慢變性溶出。

1.3.2 魚皮水解液中膠原蛋白質量分數的計算

用考馬斯亮藍的方法，使用可見光分光光度計測定樣品中的蛋白質量分數。根據測出的蛋白質量和煮出溶液的體積計算膠原蛋白中蛋白質的質量分數，再根據所用魚皮中蛋白質的總質量分數計算出膠原蛋白的得率。

1.3.3 魚皮可溶性膠原的SDS-PAGE電泳測定

采用LaemmLi[5]的方法，用8%的分離膠和5%的濃縮膠，樣品上樣量為30 μL。電極緩沖液為0.05 mol/L的Tris-Gly緩沖液。

1.3.4 提取液中羥脯氨酸含量的測定

1.3.4.1 羥脯氨酸標準曲線的繪制

根據測得的不同質量濃度羥脯氨酸的OD值，繪制標準曲線。

圖1 羥脯氨酸標準曲線圖

1.3.4.2 樣品中膠原蛋白質量分數的計算

X=a×11.1/m

式中，X為樣品中膠原蛋白的質量分數，mg/g；a為測定液中羥脯氨酸的質量濃度，mg/mL；m為稱取樣品的質量，g；11.1為膠原蛋白水解為羥脯氨酸的系數。

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白的提取

2.1.1 pH對膠原蛋白提取率的影響

將經過預處理后的魚皮按1∶100加入去離子水，放在磁力攪拌器上進行加熱保溫并攪拌。由圖2可以看出膠原蛋白的提取率在pH為2～4時提取率均較低，而在pH 5左右達到最大。

圖2 pH對膠原蛋白提取率的影響

2.1.2 溫度對膠原蛋白提取率的影響

從圖3中可看出，30～40 ℃時魚皮的蛋白提取率逐漸增高，40～60 ℃時的提取率逐漸下降。溫度在從30 ℃升高到40 ℃的過程中，膠原蛋白的水解速度加快，但當溫度過高時，膠原蛋白肽鏈的斷裂也急速加劇，產生大量的肽鏈片段，膠原蛋白的提取率也隨之下降。

圖3 溫度對膠原蛋白提取率的影響

2.1.3 提取時間對膠原蛋白提取率的影響

由圖4可以看出，提取時間在12～24 h時，膠原蛋白的提取率逐漸提高，24～36 h時提取率基本平穩，在36 h之后膠原蛋白的提取率有所下降，可能是由于水解時間過長，破壞了膠原肽鏈，所以提取率反而下降。

圖4 提取時間對膠原蛋白提取率的影響

2.2 響應面法優化實驗條件

選取溶液pH(X1)、抽提溫度(X2)和抽提時間(X3)作為考察因素，膠原蛋白的提取率作為指標。數據如表1所示。水抽提過程中pH、溫度和時間之間相互作用對指標值的影響采用響應面圖分析，結果如圖5所示。當自變量逐漸接近中心點時，膠原蛋白的提取率逐漸提高。3個因素對提取率影響關系為X3>X2>X1，即時間(X3)對膠原蛋白提取率的影響較大。

表1 pH、溫度、時間的編碼處理

圖5 pH(X1)、溫度(X2)和抽提時間(X3)對膠原蛋白提取率的影響

y=-9.043 10E-04X1+0.106 715X2+

0.085 656X3-0.293 958X12-

0.342 179X22-0.349 687X32-

0.035 450X1X2+0.063 791 4X1X3+

0.085 029 3X2X3+0.840 337

解得X1=0.003 546，X2=0.173 6，X3=0.143 9。計算得膠原蛋白提取最佳工藝為溫度41.74 ℃(取42 ℃)、pH 5.0、抽提時間25.72 h，將X1、X2、X3帶入方程解得y值為85.86%，在此實驗條件下測得膠原蛋白的實際提取率為83.75%，與理論值相差不大。

2.3 鱈魚皮膠原蛋白的分子質量分布

膠原蛋白包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等。其中Ⅰ型由兩條相同的α1(Ⅰ)和一條不同的α2(Ⅰ)肽鏈構成，即[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)。采用SDS-PAGE觀察膠原蛋白分子中α鏈的分布，如圖6所示。

A、B，樣品；C，標準品

鱈魚皮的水解液中至少含有兩條不同的α鏈(α1和α2)及其聚合鏈，分子質量都在100 ku以上。條帶α1內可能含有α3，但在SDS-PAGE上無法辨別。α1和α2兩個不同亞基的存在證實了鱈魚皮中膠原蛋白主要是Ⅰ型膠原蛋白。

3 結 論

經過響應面法優化之后得出了膠原蛋白提取的最佳工藝條件為pH 5.0、溫度42 ℃、提取時間25.72 h。最優條件下膠原蛋白的提取率為83.75%，鱈魚皮中的膠原蛋白主要為Ⅰ型。

[1] 史京京,陳麗娟,王穎,等. 膠凍強度與明膠α組份關系的研究[J]. 感光科學與光化學, 2002, 20(6):462-467.

[2] NOMURA Y, SAKAI H, ISHII Y, et a1. Preparation and some properties of type I collagen from fish scales[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1996, 60:2092-2094.

[3] 劉曉寧，劉安軍，曹東旭，等.魚鱗膠原蛋白的提取鑒定初探[J].食品研究與開發， 2007, 28(1):56-60 .

[4] 林家福，謝福美，易美華，等.熱水提取羅非魚魚皮膠原蛋白的研究[J].中國熱帶醫學， 2008, 8(8):1317-1318,1328。

[5] 李建武,蕭能庚,余瑞元,等. 生物化學實驗原理和方法[M]. 北京:北京大學出版社, 1997:165-266.