真菌產人參皂苷葡萄糖苷酶基因的調取

杜 楓， 金 鳳 燮， 魚 紅 閃

( 大連工業大學 生物工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參的有效成分主要包括人參皂苷、多糖等[1]。人參皂苷在延緩衰老和治療老年性疾病及其引起的認知性功能障礙和性功能障礙等方面均有很好的療效，并且具有抑制腫瘤的生長、調節機體免疫功能的作用[2-3]。人參皂苷是由糖和苷元相連而成的糖苷類化合物[4]。其中Rb1、Rd、Re等皂苷含量較高，而Rh1，Rh2和C-K等則非常稀有。本實驗室篩選出的AbsidiaSp.R84g菌株所產的人參皂苷糖苷酶可以水解Rb1為F2和C-K，此酶暫命名為人參皂苷葡萄糖苷酶，英文縮寫為GluGF。本實驗室前期實驗測得該酶的最適酶反應溫度為30 ℃、最適酶反應pH為5.0，酶蛋白分子質量約為71 ku，但其基因未知。本文應用RACE法調取該菌株產GluGF基因。

1材料方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

Absidiasp.R84g菌株由大連工業大學生物與食品工程學院菌種保藏所提供。

1.1.2 培養基

采用麩皮浸出液40 mL +人參浸出液60 mL，經過121 ℃、20 min高壓高溫滅菌后使用。

1.1.3 設備儀器

電泳儀，高速冷凍離心機，PCR儀，快速離心機，紫外分析儀，快速混勻器，分光光度計。

1.1.4 主要試劑

TaKaRa RNAiso Reagent，Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit， TaKaRa LA Taq，DNaseI(RNase Free)，RNase Inhibitor，DNA Marker，TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit, High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit等,Takara公司；苯酚、氯仿、乙醇、瓊脂糖，異戊醇等,科密歐(天津)化學試劑有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 簡并引物

根據測得的人參皂苷葡萄糖苷酶蛋白N端序列ATLDSWLSNEATVAR，并借助軟件Primer Premier 5.0[6]試劑盒中找到相應的5′-CDS Primer與3′-CDS Primer。

1.2.2 總RNA的提取和檢測

使用RNAiso Reagent提取總 RNA：菌體經低溫凍結后加入適量液氮后研磨，滴加RNAiso勻漿并于室溫下靜置5 min隨后滴加氯仿(1/5 RNAiso體積)，于室溫下靜置5 min再經由12 000 r/min 4 ℃離心15 min，然后移至新離心管滴加等體積的異丙醇，于室溫下靜置10 min，再經由12 000 r/min 4 ℃離心10 min并向沉淀中滴加乙醇，然后12 000 r/min 4 ℃離心5 min后棄上清，將沉淀用適量DEPC水溶解，取1 μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 RT-PCR擴增出cDNA片段

使用RT-PCR試劑盒進行反轉錄合成cDNA，同時設立M-MLV(-)對照。

5′RACE：反應體系中含有RNA，5′-CDS Primer，BD SMART A oligo, Sterile H2O反應所采用的條件為70 ℃，2 min，反應結束后立即放置于冰上2 min。隨后加入5×First-Strand Buffer、200 μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)，dNTP(10 mmol/L)與DTT(20 mmol/L)繼續反應，反應所采用的條件為42 ℃、90 min，滴加100 μL Tricine-EDTA buffer繼續反應，反應條件為72 ℃、7 min。

3′RACE：反應體系中含有RNA、3′-CDS Primer、Sterile H2O，反應條件為70 ℃、2 min。反應后立即冰上放置2 min，加入5× First-Strand Buffer、200 μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)，DTT(20 mmol/L)和dNTP(10 mmol/L)繼續反應，反應條件為42 ℃、90 min，然后加入100 μL Tricine-EDTA buffer繼續反應，反應條件為72 ℃、7 min。

1.2.4 cDNA3′、5′RACE法全長擴增

1.2.4.1 引物設計

使用軟件Primer Premier 5.0[5]，根據RT-PCR得到的cDNA片段，同時參考真菌偏愛的密碼子，設計特異性引物如下：

3′RACE上游外側引物F3：

5′-CCCTTTTAGACGCAACTGAGAGC-3′

23 mers

3′RACE上游內側引物F4：

5′-CCCAGCATCATTACTCCTCAGCA-3′

23 mers

5′RACE R1：

5′-AGC NAC NGT NGC YTC RTT-3′

18 mers

1.2.4.2 Outer PCR反應

根據5′和3′-Full RACE 試劑盒的操作手冊中的方法，分別配置含5′RACE Outer Primer、LA Taq，3′RACE Outer Primer以及特異性引物F3、F4，R1的Outer PCR反應液，采用反轉錄得到的產物作為模板進行Outer PCR反應。

1.2.4.3 Inner PCR反應

根據5′和3′-Full RACE Kit的操作手冊中的方法，采用Outer PCR反應中得到的產物作為模板進行Inner PCR反應。分別取反應液5 μL，應用3%和1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4.4 產物回收及測序

采用產物回收試劑盒中提供的手冊中的方法，進行PCR產物回收操作，并送交TaKaRa公司進行序列測定。

2 結果與討論

2.1 總RNA提取結果檢測

用“1.2.2”的方法提取總 RNA，采用RNA純化法除去樣品中的染色體DNA。純化后取1 μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。從圖1可以看出，染色體DNA已基本被除去，RNA條帶清晰，完整性較好。測得A260/A280約為1.95，可以進行反轉錄操作。

1，DNase I處理的總RNA；M，DL 2000 DNA Marker

2.2 cDNA 3′、5′ RACE法全長擴增結果

2.2.1 cDNA 5′RACE擴增結果

經反轉錄合成cDNA的片段，進行套式PCR反應和反轉錄反應后，取5 μL反應液進行3%的瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2。由圖2可以看出，在250 bp處以下有清晰條帶。對PCR產物切膠回收，測序得長度為154 bp。

1，5′RACE PCR產物；2，M-MLV(-)對照；M，DL 2000 DNA Marker

2.2.2 cDNA 3′RACE擴增結果

經過反轉錄得到cDNA片段，進行套式PCR反應和反轉錄反應后，吸取5 μL反應液采用3%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測結果見圖3。由圖3可以看出在2 000 bp左右有清晰條帶。對PCR產物切膠回收，測序得長度為1 920 bp。

1，3′RACE PCR產物；2，M-MLV(-)對照；M1，DL 2000 DNA Marker；M2，λ-Hind Ⅲ DNA Marker

2.3 產物GluGF基因全序列的獲得

根據實驗測得的5′和3′RACE產物序列，再次設計引物進行二次RT-PCR得到反應液，取1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖4所示。由圖4可以看出在2 000 bp處有清晰條帶。

1，二次RT-PCR產物； M，DL 2000 DNA Marker

將得到的二次RT-PCR產物測序得到產GluGF基因全序列。應用SequencherTM軟件分析確定其CDS區并翻譯成氨基酸序列，包括640個氨基酸，CDS區全長為1 923 bp。使用Propsearch軟件計算其組成的蛋白質分子質量約為70.4 ku，與實驗前期得到的人參皂苷葡萄糖苷酶的分子質量71 ku基本一致，因此可以認定所得到的序列是目的基因的序列。

3 結 論

根據人參皂苷糖苷酶的N端氨基酸序列設計簡并引物，以RT-PCR得到cDNA片段，采用3′與5′端的特異性引物，以菌種總RNA為模板進行擴增，得到cDNA3′及5′末端的基因序列，進而得到目的基因的CDS區全序列。將得到的序列翻譯成氨基酸，經計算可知由其編碼的蛋白質分子質量約為70.4 ku，與前期實驗純化出的人參皂苷糖苷酶的分子質量71 ku基本一致，可以認定所得目的基因的CDS區全序列是正確的。

[1] 白龍律,臧蘊霞,尹成日. 微生物轉化人參皂苷Rb1為Rg3的研究[J]. 延邊大學學報, 2009, 35(2):141-144.

[2] SHIBATA S. Future development of ginseng studies[M]. Tokyo:Hirokawa Publishing Company, 1989:145-148.

[3] 張均田. 人參研究的回顧和展望[J]. 藥學學報, 1995, 30(5):321-325.

[4] 張怡軒,陳曉瑩,趙文倩. 人參皂苷生物轉化的研究進展[J]. 沈陽藥科大學學報, 2008, 25(5):419-422.

[5] 任亮,朱寶芹,王海燕,等. 利用軟件Primer Premier 5. 0進行PCR引物設計的研究[J]. 錦州醫學院學報, 2004, 25(6):43-46.