生物傳感器法測定蔗糖轉化反應的速率常數*
——經典動力學實驗的綜合性設計示例

楊海朋 柳文軍 蘇軼坤 肖飛 戈早川 湯皎寧

(深圳大學材料學院深圳市特種功能材料重點實驗室 廣東深圳 518060)

測定化學反應的速率常數是物理化學實驗中動力學部分的重要內容。根據不同化學反應的特點，實驗教材常常采用不同方法測定反應的速率常數，如電導法、旋光法、分光光度法等[1]。這些實驗方法由于有助于開闊學生的眼界，訓練基本實驗技能，已為眾多高校物理化學實驗教學所采用。此外，為了完善創新人才培養機制，提高本科生培養水平，還需要在教學中設置一些綜合性實驗[2]。本文介紹將“旋光法測定蔗糖轉化反應的速率常數”這一經典動力學實驗改造為綜合性實驗的探索。

生物傳感器通常由生物識別元件(bioreceptor)和信號轉換器件(transducer)兩個部分組成，其中生物識別元件由生物活性物質(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本身(細胞、細胞器、組織等)構成，而信號轉換器通常是一個獨立的化學或物理敏感元件，可采用電化學、光學、熱學、壓電等多種不同原理工作。把生物識別元件同信號轉換器件相結合，就可以構成多種多樣的生物傳感器[3-6]。納米電化學生物傳感器是將納米材料作為一種新型的生物傳感介質，與特異性分子識別物質如酶、抗原/抗體、DNA等相結合，并以電化學信號為檢測信號的分析器件。由于生物傳感器的生物識別單元選擇性專一，可以獲得很好的抗干擾能力和極高的靈敏度。包括電化學生物傳感器在內的生物傳感器自誕生以來就一直是科學工作者關注的熱點[6-7]。

本實驗設計根據蔗糖轉化反應的特點，引入作者課題組最新制備的碳納米管-聚環糊精葡萄糖生物傳感器[5]，通過對反應產物葡萄糖濃度的原位測定，計算出蔗糖轉化反應的速率常數。把這一經典動力學實驗與當前的科研熱點內容相結合，使其成為一個綜合性探索實驗項目。

1 實驗設計原理

在催化劑(H+離子或者蔗糖酶)存在的條件下，蔗糖在水中可以水解為葡萄糖和果糖，反應如下：

蔗糖水解反應是一個二級反應。但由于水是大量存在的，在反應過程中可以認為濃度不變；反應過程中的氫離子是催化劑，可以認為濃度不變。因此，蔗糖水解反應可作為一級反應來處理，又稱為“假一級反應”。如果以c表示t時刻的反應物濃度，k表示反應速率常數，則反應的速率方程為：-dc/dt=kc。對此式積分可得：

lnc=-kt+b

(1)

式中b為積分常數。 在不同時間測定反應過程中的反應物濃度，以lnc對t作圖，可以求出反應的速率常數k。

由于反應是不斷進行的，因此需要即時分析出反應物蔗糖的濃度。在實驗教材中是根據反應物蔗糖和產物葡萄糖及果糖旋光能力的不同，利用體系在反應進程中旋光度的變化來分析蔗糖濃度的變化[1]。

由于蔗糖分解產物是穩定存在的葡萄糖和果糖，蔗糖濃度降低速率等于葡萄糖或果糖濃度增加速率。因而傳感器只要能夠測定這3種物質中任意一種物質的濃度變化就可以了。本文采用納米電化學葡萄糖生物傳感器，通過檢測葡萄糖濃度的變化計算反應速率常數。

設葡萄糖的濃度為cg，蔗糖初始濃度為c0，則蔗糖濃度c=c0-cg。葡萄糖濃度cg正比于傳感器響應電流的大小，設比例系數為a，則cg=aI，c0=aI∞，I∞是反應終了時的電流強度(此時可認為蔗糖已全部轉化為葡萄糖及果糖)。代入公式(1)，得到：

ln(I∞-I)=-kt+b′

(2)

實驗中測得I-t曲線和I∞，以-ln(I∞-I)對t作圖，所得直線的斜率就是蔗糖轉化反應的速率常數k。

2 實驗示例

2.1 傳感器制備

把一定量的碳納米管(CNT)放入環糊精(CD)和預聚環糊精的混合液中超聲混合，用微量進樣器吸取混合液20μL,置于干凈的玻璃片上，加入20μL 2.5%戊二醛和0.2mol/L鹽酸的等比例混合液，攪拌均勻。再用微量進量器吸取20μL上述溶液滴到Pt電極上，在室溫下自然晾干后，得到聚環糊精-碳納米管(CDP-CNT)復合膜修飾電極。在CDP-CNT膜上滴加3μL 葡萄糖氧化酶(Gox)溶液和3μL 2.5%戊二醛溶液，待其在室溫下干燥后即得到CDP-CNT復合膜修飾的納米電化學葡萄糖生物傳感器。

2.2 葡萄糖濃度測定

圖1 連續加入葡萄糖溶液時傳感器的電流響應曲線

以飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，利用CHI660C電化學工作站測定體系的電流-時間信號[5]。電流測量過程為：在不含底物的緩沖溶液中施加一定電壓，當背景電流趨于穩定后，加入一定量的底物溶液。隨著底物溶液的注入，電極產生響應電流。圖1顯示在10mL緩沖溶液(pH 5.5)中連續加入50μL 0.1mol/L的葡萄糖溶液時，傳感器對葡萄糖的電流響應曲線，所加電壓為0.6V。可以看到電流從一個穩態到達另一個穩態的平衡時間小于2s，也就是說傳感器對葡萄糖的響應時間小于2s，可以實現對反應產物葡萄糖濃度的原位測定。圖1中插圖是葡萄糖濃度c(mmol/L)與電流I(μA)的關系曲線，其線性擬合方程為I=0.055+0.60c(n=5,R=0.9998)。由此可見傳感器響應電流的大小與葡萄糖濃度有很好的線性關系。

2.3 蔗糖轉化反應速率常數測定

用pH 5.5 的緩沖溶液配制質量分數為33.3%的蔗糖溶液和0.1%的蔗糖酶溶液。在測試裝置中加入8.0mL蔗糖溶液，在0.6V電壓下測定電流-時間曲線，待背景電流穩定后，加入2.0mL蔗糖酶溶液，開始蔗糖轉化反應。隨著反應進行，反應產物葡萄糖的濃度不斷增大，測得的電流也相應增大，一直測到電流趨于飽和時實驗結束，飽和電流值即可認為是I∞。測量結果示于圖2。以-ln(I∞-I)對t作圖，所得曲線示于圖3。圖3中擬合線的斜率即蔗糖轉化反應的速率常數k。數據擬合的線性方程為：y=9.9114+0.0162x(n=151,R=0.97)，由此得到本實驗條件下蔗糖轉化反應的速率常數為k=0.0162s-1。

圖2 蔗糖轉化反應過程中傳感器的電流響應曲線

圖3 利用葡萄糖響應電流值計算得到的-ln(I∞-I)-t關系曲線

3 結語

本文根據蔗糖轉化反應的特點，引入當前科學研究的熱點課題，把經典動力學實驗改造成為一個綜合性探索實驗。在實際教學中，可根據課時的多少靈活安排。如傳感器的制備和測試部分，可以要求學生自己查閱專業文獻,寫出詳細的實驗步驟，也可以由實驗講義直接提供實驗步驟。綜合性、探索性實驗的設置，能夠調動學生學習的主動性和創造性，有助于學生創新思維能力和綜合素質的培養，是教學改革實踐中的重要環節，也是提高教學質量的重要措施[2,8]。本文為綜合性實驗的一個實例，希望能夠起到拋磚引玉的作用，以便在實驗教學改革中設計出更多的綜合性實驗，提高本科生培養水平。

[1] 莊繼華.物理化學實驗.第3版.北京:高等教育出版社,2006

[2] 孟慶繁,逯家輝,王貞佐,等.實驗室研究與探索,2004,23:85

[3] 董紹俊,車廣禮,謝遠武.化學修飾電極.修訂版.北京:科學出版社,2003

[4] 麥智彬,譚學才,鄒小勇.分析測試學報,2006,25:120

[5] Yang H P,Zhu Y F,Chen D C,etal.BiosensorandBioelectronics,2010,26(1):295

[6] Wang J,Musameh M,Lin Y.JAmChemSoc,2003,125:2408

[7] 楊海朋,陳仕國,戈早川,等.化學進展,2009,21:210

[8] 左鐵鏞.實驗室研究與探索,2008,27:1