胰島素樣生長因子-1對癡呆模型大鼠額葉、海馬Caspase-3 P20活性片段及 Bcl-2蛋白表達的影響

石廣濱, 劉 群, 張 昱, 劉洪敏

阿爾茨海默病(AD)是一種神經退行性疾病,其病理特征是神經原纖維纏結、老年斑產生和神經元丟失。其中細胞凋亡是神經元丟失的重要途徑,并受 caspases家族和 Bcl-2家族調控。在老年動物中樞神經系統中,尤其是海馬結構中 IGF-1表達呈年齡相關性下降[1],有研究證實給予 IGF-1抗體的大鼠學習記憶能力顯著下降[2]。因此,認為 IGF-1具有改善老齡動物學習、記憶的能力[3]。研究表明IGF-1可抑制體外培養的神經細胞凋亡[4],IGF-1改善老齡動物學習記憶能力可能與抑制細胞凋亡有關。本實驗觀察穹隆海馬傘切斷后 caspase-3 P20活性片段及 Bcl-2表達的變化,并研究 IGF-1對其影響,探討 IGF-1治療 AD的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腦立體定位儀(韓國),Colded CCD圖像采集系統(日本),Image-pro p lus圖像分析系統(美國),大鼠特異胰島素樣生長因子-1(Peprotech EC公司,英國),兔抗鼠 Caspase-3 P20多克隆抗體(Santa Cruz公司),生物素化羊抗兔 IgG/Bio(Sigma公司),羊抗鼠 Bcl-2多克隆抗體(Santa Cruz公司),生物素化兔抗羊 IgG/Bio(Sigma公司),DAB顯色劑(天津灝洋生物公司),雙刃刀(自制)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型建立 Wistar雄性大鼠,鼠齡 3～4個月,體重 200～250g,全部大鼠在正常溫控、光照及自由攝食條件下飼養。用水迷宮篩選反應迅速、活躍的大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、癡呆組、小劑量 IGF-1組、大劑量 IGF-1組,每組 10只大鼠。用 10%水合氯醛 0.33m l/100g腹腔麻醉動物;將其固定在大鼠腦立體定位儀上;常規剪毛、消毒;正中切開頭皮,暴露出顱骨。參照大鼠腦立體定位圖譜[5],取前囟后 2.2mm,中線左右各旁開 1.0mm處,牙鉆鉆開顱骨,切開骨膜;用雙刃刀片(寬3.0mm、長30.0mm)置于上述部位的腦表面,行冠狀切口;然后降刀 4.5mm,外移 1.0mm,再降刀 1.0mm,外移1.5 mm;接著上下提插刀 20次,以保證雙側海馬傘外側緣完全切斷;最后抽出刀片,注意無菌操作,皮膚切開處給予少許青霉素粉劑,縫合切口。假手術組只鉆開顱骨,不切斷海馬傘。正常對照組不給予任何處置。所有實驗動物都給予常規飼養。

1.2.2 側腦室給藥方法 參照上述立體定位圖譜,在大鼠腦立體定位儀下取前囟后 0.8mm,中線左旁開 1.8mm處,鉆開顱骨,垂直埋入剪短的硬膜外導管,深度為硬膜下 3.7mm,去掉導絲回抽見腦脊液后,牙粉固定導管,縫合皮膚。以后給藥時可拔除導絲,用 10μl微量進樣器注射,注射結束后重新插入導絲,消毒包扎固定。癡呆模型制備 1d后開始側腦室給藥,連續 21d。小劑量 IGF-1組給予IGF-1 10μl(0.2μg/μl),大劑量 IGF-1組給予 IGF-1 10μl(0.5μg/μl),癡呆組和假手術組則同時間給予生理鹽水 10μl。注射時間大約為 10min,注射完后停留 2min再迅速拔針。正常對照組不給予任何處置。實驗結束后,注射亞甲藍溶液 2μl證實注射部位確實在側腦室。

1.2.3 標本制作及觀察 給藥 21d后將實驗動物進行如下處置：4%多聚甲醛灌注取腦,制成蠟塊,每只鼠在靶區附近連續切片,片厚 4～5μm,分別行 Bcl-2、caspase-3免疫組化染色;切片脫蠟后經30g/L H2O2處理,正常羊血清封閉后,分別滴加羊抗鼠 Bcl-2、兔抗鼠 caspase-3,按 SABC法操作然后應用電子計算機數字圖像系統進行分析。

2 結 果

2.1 IGF-1對癡呆模型大鼠額葉、海馬caspase-3 P20活性片段的影響 (1)正常對照組和假手術組額葉、海馬 caspase-3 P20陽性細胞數很少,陽性反應弱(見表1、表2);(2)穹隆海馬傘切斷術后 3d,大鼠額葉、海馬均可見 caspase-3 P20陽性神經元明顯增多,呈強陽性表達,14d后 caspase-3 P20陽性神經元開始減少,但 21d時額葉、海馬神經元中 caspase-3 P20仍有一定表達(見表1、表2),多數 caspase-3 P20陽性神經元胞膜、胞質著色較深,部分神經元胞核著色,呈棕色或棕黃色,多伴胞體萎縮,說明穹隆海馬切斷后啟動了凋亡機制;(3)小劑量 IGF-1組和大劑量 IGF-1組與癡呆組相比,細胞陽性反應顯著減弱,IOD值明顯降低,具有顯著差異(P＜0.001)(見表1、表2),說明 IGF-1能夠抑制caspase-3 P20活性片段的表達,減少細胞凋亡的發生;(4)小劑量 IGF-1組與大劑量 IGF-1組比較,Caspase-3 P20陽性神經元 IOD值明顯降低,具有顯著性差異(P＜0.05或 P＜0.01)(見表1、表2),說明小劑量 IGF-1對caspase-3 P20的抑制作用較大劑量 IGF-1更顯著。

2.2 IGF-1對癡呆模型大鼠額葉、海馬 Bcl-2蛋白表達的影響 (1)正常對照組和假手術組額葉、海馬 Bcl-2陽性細胞數很少(表3、表4);(2)癡呆組額葉、海馬 Bcl-2蛋白在術后 3d表達量最高,持續到 14d,21d陽性神經元免疫反應強度下降(見表3、表4),Bcl-2陽性神經元胞漿呈棕黃色,部分神經元胞核著色;(3)小劑量 IGF-1組和大劑量 IGF-1組與癡呆組相比,額葉、海馬 Bcl-2陽性神經元明顯增多,著色變深,IOD值明顯增加,具有顯著差異(P＜0.001)(見表3、表4);(4)小劑量 IGF-1組與大劑量 IGF-1組比較,Bcl-2陽性細胞增多,IOD值明顯增高,差異顯著 (P＜0.05或 P＜0.01)(見表3、表4),說明小劑量 IGF-1能夠更加顯著的促進 Bcl-2蛋白的表達。

表1 各組大鼠額葉caspase-3 P20陽性細胞光密度值(±s,n=10)(×106)

表1 各組大鼠額葉caspase-3 P20陽性細胞光密度值(±s,n=10)(×106)

與癡呆組相比*P＜0.001;與小劑量 IGF-1組相比△P＜0.01,#P＜0.05

組別 3d 7d 14d 21d正常對照組假手術組癡呆組小劑量 IGF-1組大劑量 IGF-1組0.18±0.07 0.22±0.06 7.56±0.39 4.61±0.27*5.01±0.36*#0.23±0.03 0.20±0.04 7.73±0.49 3.87±0.25*4.25±0.37*#0.24±0.06 0.23±0.05 6.45±0.57 3.37±0.32*4.16±0.57*△0.21±0.05 0.19±0.08 5.36±0.21 2.13±0.16*3.97±0.12*△

表2 各組大鼠海馬caspase-3 P20陽性細胞光密度值(±s,n=10)(×106)

表2 各組大鼠海馬caspase-3 P20陽性細胞光密度值(±s,n=10)(×106)

與癡呆組相比*P＜0.001;與小劑量 IGF-1組相比△P＜0.01,#P＜0.05

組別 3d 7d 14d 21d正常對照組假手術組癡呆組小劑量 IGF-1組大劑量 IGF-1組0.19±0.02 0.18±0.03 8.43±0.72 4.52±0.45*5.12±0.57*#0.21±0.05 0.16±0.06 7.67±0.78 3.36±0.16*4.05±0.76*#0.18±0.06 0.17±0.05 7.89±0.12 4.39±0.46*5.11±0.68*#0.20±0.05 0.19±0.04 5.39±0.32 1.67±0.15*3.89±0.27*△

表3 各組大鼠額葉Bcl-2陽性細胞光密度值(±s,n=10)(×106)

表3 各組大鼠額葉Bcl-2陽性細胞光密度值(±s,n=10)(×106)

與癡呆組相比*P＜0.001;與小劑量 IGF-1組相比△P＜0.01,#P＜0.05

組別 3d 7d 14d 21d正常對照組假手術組癡呆組小劑量 IGF-1組大劑量 IGF-1組0.71±0.21 0.70±0.25 5.26±1.17 9.97±2.13*8.37±1.29*△0.68±0.17 0.72±0.31 4.97±1.25 9.36±2.53*7.26±1.27*#0.73±0.24 0.69±0.22 4.22±1.31 8.49±1.77*6.37±1.35*△0.74±0.29 0.73±0.26 3.09±1.02 7.21±1.23*5.86±1.38*#

表4 各組大鼠海馬Bcl-2陽性細胞光密度值(±s,n=10)(×106)

表4 各組大鼠海馬Bcl-2陽性細胞光密度值(±s,n=10)(×106)

與癡呆組相比*P＜0.001;與小劑量 IGF-1組相比△P＜0.01,#P＜0.05

組別 3d 7d 14d 21d正常對照組假手術組癡呆組小劑量 IGF-1組大劑量 IGF-1組0.89±0.12 0.91±0.23 5.67±1.32 11.98±2.15*9.56±2.46*#0.88±0.24 0.86±0.31 4.36±1.21 10.25±1.47*8.37±1.32*△0.90±0.21 0.87±0.23 4.03±1.16 8.76±1.56*6.24±1.28*△0.92±0.35 0.89±0.26 3.25±1.12 6.89±1.25*5.16±1.52*#

3 討 論

細胞凋亡是 AD神經元丟失及其它病理學特征形成的主要原因。Smale等[6]研究發現,AD患者腦內海馬區細胞凋亡明顯增加,而正常腦內幾乎沒有或很少有細胞凋亡。

細胞根據所處環境條件不同和啟動細胞凋亡刺激不同,通過不同的途徑發生凋亡,如死亡受體轉接蛋白途徑、線粒體-細胞色素 C途徑,caspases家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要作用,無論通過哪種途徑,caspase-3都是凋亡的執行者。Shimohama觀察到,AD患者大腦中 caspase-3蛋白水平較正常對照組明顯增加[7],在細胞培養中,caspase-3可被 Aβ25-35、活性氧 (ROS)及鈣穩態的失衡而激活[8]。在低濃度時,三羥基異黃酮 (genistein)能通過活化雌激素受體(ER),有效地抑制 thapsigargin(內質網 Ca2+-ATP酶抑制物)誘導的 caspase-3激活,阻止細胞凋亡[9]。隨著對細胞凋亡的深入研究,目前很多學者認為 caspases的激活是細胞凋亡不可逆轉的標志[10],因此對這一激活步驟的阻斷是藥物發揮保護作用的關鍵機制之一。

本實驗研究發現正常大鼠額葉、海馬有少量caspase-3 P20弱陽性細胞分布,癡呆組術后 3d大鼠額葉、海馬均可見 caspase-3 P20陽性神經元明顯增多,呈強陽性表達,14d后 caspase-3 P20陽性神經元開始減少,但 21d時神經元中 caspase-3 P20仍有一定表達,說明穹隆海馬傘切斷術可以觸發 caspase-3調亡途徑,引起細胞凋亡發生。IGF-1小劑量組和IGF-1大劑量組與癡呆組比較,caspase-3 P20陽性神經元數量顯著減少,細胞著色變淺,提示 IGF-1能夠通過抑制 caspase-3活化,進而抑制細胞凋亡,促進額葉、海馬內神經元存活。

B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphone/leukemia-2,Bcl-2)蛋白可抑制 caspase-3裂解活化。發揮其抑制凋亡的作用。也有研究證實 Bcl-2作用于神經系統的發育過程,具有抑制細胞凋亡及類神經營養的作用[11]。

本研究結果發現正常大鼠海馬 Bcl-2蛋白表達較少,癡呆組大鼠 Bcl-2蛋白表達反應性增多,IGF-1小劑量組和 IGF-1大劑量組與癡呆組比較,大鼠額葉、海馬 Bcl-2蛋白表達明顯增加,同時 caspase-3 P20活性片段表達較少,差異顯著,提示 IGF-1通過增強 Bcl-2蛋白表達,減少 caspase-3的裂解活化,抑制細胞凋亡,促進額葉、海馬內神經元存活及損傷修復。IGF-1引起 Bcl-2基因表達改變的作用機制尚不完全清楚。

有研究認為 IGF-1能激活細胞核轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白(CREB),調節 Bcl-2啟動子,因此可能在轉錄水平提高 Bcl-2表達[12]。也有研究認為 IGF-1可以通過 PI3-Kinase/Akt途徑改變Bcl-2的表達,抑制 NO誘導的原代海馬神經元凋亡[13]。

本研究結果證實,小劑量 IGF-1比大劑量 IGF-1能更有效地抑制 caspase-3 P20表達,并促進 Bcl-2表達,由此,本研究推測 IGF-1發揮其神經保護作用存在著一個最佳劑量,但最佳劑量尚需今后做大量研究工作來確定。

本研究表明 IGF-1能夠通過抑制 caspase-3的裂解活化,促進 Bcl-2的表達,減少神經細胞的凋亡。因此,IGF-1有可能成為 AD治療的神經保護性藥物之一。

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