甘草次酸在Caco－2細胞模型中的轉運機制1)

王筱萌 祖元剛 王 微 付玉杰 張 琳

(森林植物生態學教育部重點實驗室(東北林業大學)，哈爾濱，150040)

傳統中藥用藥大多數為口服，藥物分子進入血液循環、到達靶器官、達到藥效程度、產生生物學效應，其中足夠量的藥物分子從胃腸道吸收是一個關鍵的環節。因此，在口服創新藥物或者先導化合物、中藥有效成分和有毒成分研究過程中，其腸吸收研究顯得非常的重要［1－3］。目前，用于藥物吸收的實驗方法包括體內和體外兩部分。盡管體內實驗能更好地反映給藥后藥物的吸收過程，但很難從細胞或分子水平研究藥物的吸收機制，而且由于動物有個體差異，建立生物樣本中藥物的分析方法難度大。另外，整體動物吸收代謝的耗藥量大，周期較長，不適合藥物開發早期的快速篩選過程。而體外實驗能提供較為直觀的藥物吸收過程的證據，因此被廣泛采用。目前，體外實驗的方法主要有:在體腸灌流法、腸襻法、分離腸黏膜法、翻轉腸法等［4］。然而，這些方法存在著動物組織與人體組織的差異性。從20世紀80年代起，國外開始應用一種人結腸癌細胞(The Human Colon Carcinoma Cell Line，簡稱Caco－2細胞)體外培養模型進行藥物的吸收研究。Caco－2細胞可在體外培養條件下自發形成上皮樣分化且可形成緊密連接，分化出絨毛面(apical side，AP端，頂端)和基底面(basolateral side，BL端，底端)，能夠表達刷狀緣酶、某些細胞色素藥物代謝酶和異構酶，諸如谷胱甘肽S轉移酶和磺基轉移酶等藥物代謝Ⅱ相酶。包括氨基酸、二肽、維生素、細胞抑制劑在內的許多轉運系統也在Caco－2細胞發現。Borchardt等［5］最早提出Caco－2細胞模型可用于研究藥物分子經小腸上皮吸收的過程。Rubas等［6］比較了一系列具有低滲透率的藥物在Caco－2細胞模型和人體小腸的吸收，結果表明:細胞培養模型能很好地模擬腸道組織。因此，Caco－2模型被廣泛應用于藥物研究與開發中，在藥物開發早期對藥物或者先導化合物的腸道吸收性質所作出的科學評價，大大推動了制藥業創新藥物開發的速度。在之前的研究中曾經報道了小檗堿、喜樹堿、9－硝基喜樹堿、紫杉醇等［7－8］在 Caco－2 細胞單層模型的轉運，預測其腸吸收，實驗結果表明:Caco－2細胞單層的體外過程與藥物口服后在腸中的吸收和代謝有良好的相關性。

甘草次酸(Glycyrrhizic acid)是甘草的主要活性成分之一，具有抗過敏、抗炎、抗潰瘍、抗病毒和保肝、解毒等功效。由于甘草次酸有大多數腎上腺皮質激素的藥理作用，無其他嚴重不良反應，被廣泛用于治療各種急慢性肝病。但長期大量使用甘草次酸或甘草制劑，可引起浮腫、鈉水潴留［9］。甘草次酸在臨床中常被用于靜脈注射，口服給藥報道很少。本實驗采用體外給藥的方法研究甘草酸的口服生物利用度。本文利用Caco－2單層模型對甘草次酸進行體外轉運的初步研究，預測甘草次酸在體內的吸收機制，并且研究了P－糖蛋白抑制劑對甘草次酸吸收的影響。

1 材料與方法

Caco－2細胞，購于中國醫學科學院腫瘤細胞庫;甘草次酸(實驗室自制)，MEM培養基(含谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷，不含碳酸鈉，美國Hyclone公司)。

細胞培養［10－12］:將 Caco－2 細胞置于常規培養瓶內，以MEM為培養基(含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%青霉素－鏈霉素雙抗液)，在溫度為37℃、體積分數為5%CO2和相對濕度90%的培養箱內培養，培養基隔天更換，4～5 d達到融合。當細胞長至覆蓋瓶底80% ～90%時，用含0.25%EDTA的胰酶消化，并以每1 mL 2.5×105個接種于Transwell聚碳酸酯膜六孔板中。在Transwell六孔板AP一側每孔加1.5 mL培養液，BL一側每孔加入2.5 mL培養液，第一個星期每天更換培養液，第8天只更換頂部培養液，8 d后每天更換頂部培養液，隔天更換底部培養液，至21 d。

跨膜電阻的測定:首先測量出沒有接種細胞之前聚碳酸脂膜的空白電阻，在計算接種細胞的TEER值時扣除空白電阻值。于接種細胞 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d 測定接種細胞的電阻值，當細胞電阻值大于300 Ω·cm－2時，說明單層細胞膜趨于完整，可用于轉運實驗。

甘草次酸雙向轉運實驗:配制甘草次酸母液濃度2000 μmol·L－1，將Transwell六孔板的上層培養液吸出，加入含有一定藥物濃度的HBSS 1.5 mL，下層加入不含藥物的HBSS 2.5 mL。①在0 h時按照圖1加藥(從藥物母液中吸取，上層加藥)。在 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，分別于下層中取出緩沖液200 μL至2 mL離心管中，取藥后立刻補充相同體積的HBSS。3.0 h后更換新的HBSS緩沖液，重復3次。②在0 h時按照圖2加藥(從藥物母液中吸取，下層加藥)。在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，分別于上層中取出緩沖液200 μL 至2 mL離心管中，取藥后立刻補充相同體積的HBSS。3.0 h后更換新的HBSS緩沖液，重復3次。

圖1 Transwell六孔板上層加入甘草次酸

圖2 Transwell六孔板下層加入甘草次酸

抑制劑對甘草次酸轉運實驗:在Transwell六孔板AP側孔1、2、3 加入 11.25 μL 濃度為 15 μmol·L－1的甘草次酸，BL側孔 4、5、6 加入 18.75 μL 濃度為 15 μmol·L－1的甘草次酸。在BL側，如圖3方法加入抑制劑，其中A為25 μmol·L－1漢防己甲素，B為50 μmol·L－1維拉帕米。取樣方法及步驟同“甘草次酸雙向轉運實驗”。其中:孔1、2、3為AP→BL側轉運，孔4、5、6 為 BL→AP 側轉運。

圖3 加入抑制劑維拉帕米和漢防己甲素

HPLC－MS/MS 分析:色譜條件——色譜柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)為 Agilent Eclipse XDB－C18，流動相為 V(甲醇)∶V(水)(含0.1%甲酸)=90 ∶10，流速為1 mL·min－1，柱溫為300℃，保留時間為8 min。

樣品處理:取200 μL樣品于2 mL離心管中，加入800 μL乙酸乙酯渦旋震蕩3 min;震蕩后3000 r·min－1離心5 min取上清液，移至新的2 mL離心管中;再向下層加入800 μL乙酸乙酯震蕩3 min，離心5 min取上清;混合2次上清液，氮氣環境揮干。殘渣用200 μL流動相溶解，震蕩3 min;12000 r·min－1離心 5 min，取上清液。

數據處理:表觀滲透系數Papp代表藥物轉運能力的大小。其公式為:Papp=(dQ/dt)/A×C0。式中:dQ/dt為接受藥物側待測藥物出現的速率，即滲透速率(單位為mmol·s－1);A為單細胞層表面積(4.2 cm2);C0為給藥測初始藥物濃度(單位為mmol·cm－3);Q(單位為mmol)為任何一點的累積轉運量=被測樣品在接受側的量+先前所有時間點取樣總量。

外排率(EfR)=P(appBL→AP)/P(appAP→BL)，代表藥物凈外排能力的大小，同時也可以預測外排作用引起的藥物口服吸收減弱的程度。P(appBL→AP)為分泌表觀通透系數，P(appAP→BL)為吸收表觀通透系數。

2 結果與分析

2.1 Caco－2細胞完整性檢查結果

形態學檢查可觀察到完整的單層上皮細胞，細胞表面覆蓋一層刷狀緣絨毛，垂直于細胞表面，并且細胞具有不對稱性，細胞間連接緊密。這些形態均與小腸上皮細胞極為相似。TEER值＞500 Ω，細胞融合成連續的單細胞層。［1－3H］甘露醇放射性活度為1.25 ～1.37 Bq，可以認為無甘露醇泄露［13］。結果表明:Caco－2細胞膜具有良好的完整性，可用于藥物轉運實驗。

2.2 甘草次酸濃度與轉運時間對轉運量的影響

應用Caco－2細胞模型，對6個濃度(0.75、1.50、3.00、7.50、15.00、30.00 μmol·L－1)的甘草次酸分別考察了從 AP側→BL側和BL側→AP側的跨細胞轉運特征。在同一時間點，6個濃度的轉運量隨濃度和轉運時間的變化而增大，并呈非線性飽和狀態(見圖4～圖6)。

圖4 甘草次酸(GA)隨轉運時間的累積通透量(AP側→BL側)

圖5 甘草次酸(GA)隨轉運時間的累積通透量(BL側→AP側)

圖6 甘草次酸(GA)在Caco－2單細胞層中濃度和流量的關系

2.3 甘草次酸在Caco－2模型中的轉運

在Caco－2細胞模型中，藥物分子的滲透系數Papp與口服吸收相關聯，Papp的大小直接反應了藥物經腸道吸收的能力。吸收良好藥物的Papp大于10－6cm·s－1，吸收較好藥物的Papp為(0.1 ～1)×10－6cm·s－1，而吸收差的藥物的 Papp小于 10－7cm·s－1［14］。若在整個濃度范圍內測得的 Papp值保持恒定，則認為被動擴散為主要轉運機制。Papp值可由AP→BL方向測得(Papp1)，也可由BL→AP方向測得(Papp2)。若Papp1與Papp2相同，也可認為被動擴散為主要轉運機制;若Papp2/Papp1＞1.5，則可能存在主動轉運機制［15］。

在甘草次酸轉運過程中，BL→AP側的轉運的表觀滲透系數 Papp由(17.1±4.2)×10－6cm·s－1變化到(54.3±6.3)×10－6cm·s－1;而AP→BL側的轉運的表觀滲透系數 Papp維持在(15.6±3.4)×10－6cm·s－1。實驗結果表明:甘草次酸的Papp大于10－6cm·s－1。所以甘草次酸口服吸收良好，甘草次酸雙側轉運流出率EfR=P(appBL→AP)/P(appAP→BL)=1.37＜1.5，則說明甘草次酸經小腸上皮吸收主要為被動擴散。

2.4 抑制劑對甘草次酸轉運實驗的影響

加入抑制劑維拉帕米后，甘草次酸從BL到AP側流出量由 16×10－6cm·s－1變化為 9.2×10－6cm·s－1，減少了 50% 左右;從 AP 到 BL 的流量從 12.9×10－6cm·s－1變化為 25.9×10－6cm·s－1，有約2.5 倍的增幅。在加入漢防己甲素后，甘草次酸從 BL 到 AP 側流出量由 16×10－6cm·s－1變化為 8.7×10－6cm·s－1，同樣減少了50%左右;從 AP到 BL的流量從12.9×10－6cm·s－1變化為 31.9×10－6cm·s－1，有約 2.8 倍的增幅(見表1)。結果表明:甘草次酸可能是細胞膜上P－糖蛋白的底物。細胞膜上的P－糖蛋白參與了甘草次酸的外排轉運，維拉帕米和漢防己甲素有抑制細胞膜上轉運載體P－糖蛋白外排的功能。

表1 維拉帕米和漢防己甲素對甘草次酸在Caco－2 單細胞層中流量的影響 10－6cm·s－1

4 結論與討論

采用Caco－2細胞模型進行藥物吸收機制研究是一種較好的模擬腸管真實的生理環境的離體實驗，作為研究藥物吸收的快速篩選工具，能夠在細胞水平提供關于藥物分子通過小腸黏膜的吸收、代謝、轉運的信息，有重現性好、易于操作、可同時研究藥物對黏膜的毒性、與人體不存在種屬差異等優點。但仍有不足，如藥物經該模型的吸收與體內實際吸收還有一定差距;細胞培養時間過長;該模型本身為純細胞系，缺乏在小腸上皮細胞中的黏液層，同時Caco－2細胞的吸收轉運體表達較小腸上皮的低，因而在主動轉運藥物的研究方面相對不如被動擴散藥物研究的成功。

本文探討了甘草次酸在Caco－2細胞模型上的雙向轉運，結果表明:甘草次酸為吸收良好的化合物且主要為被動擴散;從P(appBL－AP)/P(appAP－BL)比值判斷，甘草次酸從BL端到AP端轉運占優勢。由此可推測出，在甘草次酸的跨膜轉運的過程中可能存在外排機制。

P－糖蛋白是一種質膜糖蛋白，是多藥耐藥基因mdr1的產物，存在于Caco－2細胞中，其功能是外排底物(或進入BL端的藥物)。若甘草次酸是P－糖蛋白的底物，P－糖蛋白會將它們排到腸腔側(AP側)［16］，使它們在小腸中的吸收量減少。這也可能是說明甘草次酸從BL側到AP側的吸收較AP側到BL側吸收好的原因，有待于下一步實驗繼續研究。

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