利用同步輻射X射線衍射研究家蠶的紡絲過程

黃 燕，張耀鵬，羅 杰，邵惠麗，胡學超

（東華大學 纖維材料改性國家重點實驗室，材料科學與工程學院，化學纖維研究所，上海 201620）

蠶絲具有質輕細長、光澤獨特、手感優良、穿著舒適等優良特性，素有“纖維皇后”之美稱。一直以來，蠶的紡絲機理都是生物學家、化學家及材料學家們的研究熱點。迄今為止，大多科學家都認為蠶的紡絲是液晶紡絲，但對于絲素蛋白的液晶形成機理，則存在多種不同說法，如Viney等［1－2］的鹽橋球狀棒理論、Magoshi等［3］的絲素液晶成纖理論、Kaplan等［4］的膠束理論及于同隱等［5－6］的折疊鏈理論等。對于絲素蛋白成纖過程中聚集態結構的形成，現有研究尚未得出一致的理論。而從蠶本身出發，研究其腺體中紡絲液的流動狀態及聚集態結構的變化，無疑對絲素蛋白的纖維化機理研究具有較重要的借鑒作用。

同步輻射作為X射線源，具有通量高、準直性高以及波長連續可調等優點［7］。同步輻射X射線衍射技術是研究生物大分子晶體的主要手段，已證實蠶絲具有半晶型形態結構［8］；生物絲具有高度可延伸性主要受其微觀結構的無序相（disordered phase）的影響，而其晶體結構也可發生彈性形變。另外，Martel等［9－10］利用同步輻射X射線衍射技術研究了pH、剪切速率［11］對微流體管道中再生絲素蛋白水溶液構象轉變的影響。本文利用同步輻射廣角X射線衍射（SR－WAXD）對五齡家蠶、解剖后的蠶腺體，以及脫膠絲進行測試，研究干燥過程及拉伸過程中腺體內絲素蛋白有序態結構的演變，并探索絲素蛋白在纖維化過程中其聚集態結構的變化過程和主要影響因素。

1 實驗

1.1 活蠶測試

將五齡家蠶經丙酮麻醉后固定于金屬實驗臺，通過改變固定蠶體的方式使其背面或側面分別置于同步輻射X射線光路中，并依次對蠶體的頭部、胸部、腹部、尾角處進行同步輻射X射線衍射測試（圖1），采用 Mar 345成像板探測器記錄二維X射線衍射結果。因蠶腺體（圖2）以Z字型折疊在蠶體內，蠶體尾角處主要有后部腺體（P），腹部中有部分后部腺體（P）、中部腺體后區（MP）和中區（MM），胸部中有中部腺體前區（MA）和前部腺體（A），頭部中只有部分前部腺體（A）、吐絲管和噴絲口。

圖1 同步輻射廣角X射線衍射測試家蠶示意圖（側面入光方式）Fig.1 Schematic setup of SR－WAXD experiment on silkworm （incident beam from lateral silkworm）

圖2 蠶腺體各區段示意圖Fig.2 Scheme of different divisions of silk gland

1.2 腺體及脫膠絲測試

1.2.1 有表皮濕態腺體 將五齡家蠶麻醉后置于培養皿中解剖，用去離子水清洗腹內，取出兩條完整的腺體備用。腺體按其P、MP、MM、MA、A進行切斷（圖2），將各樣品貼附于聚酰亞胺膜（商品名Kapton）上，對其進行同步輻射X射線衍射測試。其中，后部腺體、前部腺體各測試1點，中部腺體各區分別測試不同兩點（即MPP、MPA；MMP、MMA；MAP、MAA）。另外，由于同步輻射X射線光斑較前部腺體大，因此，前部腺體測試時需將同等長度的5根前部腺體并排進行測試。

1.2.2 去表皮濕態腺體 將蠶內腺體取出后，用去離子水浸泡約30s，再用尖嘴鑷子將其白色表皮剝除，由于前部及后部腺體的表皮不易去除，本實驗僅將中部腺體切為MP、MM、MA 3段進行測試，方法同上。

1.2.3 腺體的干燥 取去表皮濕態腺體MM、MA兩段分別進行干燥，每隔5min左右測試1次，且用稱重法對其稱量，若5min內其質量波動范圍在0.1%之內，即認為腺體已完全干燥。總測試時間約為1～2h，測試方法同上。

1.2.4 腺體及脫膠絲的拉伸 將去表皮濕態腺體MM固定于自制拉伸儀，分別以拉伸速度17.4及29.0μm／s進行拉伸，并對其進行同步輻射X射線衍射原位測試。為了對比結果，將成束脫膠絲［12］固定于相同光路進行X射線衍射測試。

1.3 同步輻射光束線參數

儲存環能量，800MeV；流強，200mA；光斑尺寸，2mm×1mm；X射線波長，0.154nm；束線阻攔器尺寸，1cm×1cm；探測器直徑，345mm；成像板像素，150μm。樣品到探測器距離與放樣方式有關，介于155～176mm。實驗過程中，光源光斑位置未隨時間變動。本實驗在國家同步輻射實驗室（合肥）X射線衍射和散射試驗站完成。

1.4 數據處理

本實驗采用聚丙烯薄片為標樣，利用軟件FIT2D對其衍射環進行圓心定位，并校準樣品到探測器距離。為避免成像板原有圖樣的影響，對樣品二維衍射圖譜的左下角部分做相同角度區域的90°扇形積分，得到其一維衍射圖譜。利用Origin 8扣除對應背景的衍射數據，得到實際樣品的一維衍射圖譜。上述標定的圓心和樣品到探測器的距離可用于相同放樣方式下的所有測試樣品。由于放樣方式不同，各樣品所扣除的背景衍射數據以及樣品到探測器距離有所不同。對于活蠶、拉伸的腺體和脫膠絲，扣除的背景是空氣的衍射數據；對于未拉伸的腺體，所扣除的背景是Kapton膜和空氣的衍射數據。對于活蠶和未拉伸的腺體（固定于出光口），校正后的樣品到探測器距離為155mm；對于拉伸的腺體和脫膠絲（固定于拉伸儀），校正后的樣品到探測器距離為176mm。當樣品固定于拉伸儀時，需移動探測器，使拉伸儀置于出光口和探測器之間。

2 結果與討論

2.1 活蠶蠶體不同部位及測試方式對其WAXD結果的影響

家蠶絲素蛋白的結晶結構通常分為絲素Ⅰ（silkⅠ）和絲素Ⅱ（silkⅡ）兩種結構［13］。silkⅡ是以氫鍵連接的反平行β－片層（β－sheet）結構，而silkⅠ由于其結構不穩定，易轉變成為結構更穩定的silkⅡ結構，使得對它的結構研究較困難，并存在一些爭議。例如：在Lotz等［14］提出的曲軸模型中，丙氨酸殘基和谷氨酸殘基分別以 β－片層和 α－螺旋構象存在；在 Fossey等［15］提出的模型中，左旋的片層結構 （lefthanded sheet－like conformation）和右旋的片層結構（right－handed sheet－like conformation）共存，且左右扭曲程度相同；Asakura等［16－17］認為silkⅠ是一種重復的Ⅱ類β－轉角結構。

使用0.154nm的X射線光束，文獻［18－19］中silkⅡ（β－片層）結構的主要結晶衍射峰在2θ＝20°左右。其中，2θ＝19.7°的衍射峰（［200］晶面，晶面間距為0.45nm）與分子鏈間的排列相關（圖3中方向a），而2θ＝20.6°的衍射峰（［020］晶面，晶面間距為0.43nm）與β－片層之間的排列相關（圖3中方向b）。由于這兩個衍射峰很接近，常重疊為1個衍射峰。另外，silkⅡ還在2θ＝8.7°、9.9°（［010］晶面）、23.3°（［002］晶面）、24.5°（［201］晶面）、27.3°（［012］或［220］晶面）、29.7°（［030］晶面）、31.8°（［022］或［130］晶面）、39.0°（［003］晶面）和39.9°（［040］晶面）處有結晶衍射峰，對應的晶面間距分別為1.01、0.895、0.38、0.36、0.326、0.301、0.281、0.231 和0.226nm。silkⅠ 的 主 要 結 晶 衍 射 峰 在2θ＝12.3°左右（晶面間距為0.72nm），2θ＝15.8°、18.9°為α－螺旋的衍射峰（晶面間距分別為 0.47nm 和 0.56nm）［13］。 另 外，2θ＝11.5°～12.5°范圍內的平緩衍射峰通常被認為與絲素蛋白無定型結構相關［18］。

圖3 silkⅡ（β－片層）結晶結構示意圖Fig.3 Scheme of silkⅡ （β－sheet）crystal structure

圖4和5分別為蠶體各部位的二維和一維X射線衍射圖譜。從圖4可看出，與蠶體胸部、腹部及尾角處相比，蠶頭部的X射線衍射圖譜明顯不同。從圖5可進一步看出，無論采用側面入光還是背面入光的方式測試，蠶體胸部、腹部和尾角處的X射線衍射曲線均較平滑，而其頭部的衍射曲線的衍射峰較明顯，強度也高于其他部位的曲線。這可能是由于X射線穿透蠶體胸部、腹部及尾角處時，被其表皮或體內器官部分吸收，因此無法得到明顯的衍射信息。蠶頭部的衍射圖譜中均有明顯衍射峰，但不同測試方式所得到的峰位和強度有所不同。當采用側面入光方式測試時，圖5a中在8.8°、19.8°及27.1°處出現了衍射峰，結合文獻［18－19］可知，這些峰分別與silkⅡ結晶結構中晶面間距為1.01、0.895及0.326nm的晶面的衍射有關。當采用背面入光方式測試時，圖5b中分別在12.3°、18.9°及27.3°附近有3個明顯的衍射峰。其中，12.3°的衍射峰是silkⅠ的衍射峰（晶面間距為0.72nm）；27.3°的 衍 射 峰 是silkⅡ 的［012］或［220］晶面的衍射峰；18.9°處的衍射峰是晶面間距為0.56nm的α－螺旋結構的衍射峰。對其的解釋可能為絲素蛋白在蠶頭部吐絲口處形成纖維的過程中，絲素蛋白大部分已轉變為silkⅡ晶體結構，但仍存在部分未轉變完成的α－螺旋結構。比較圖5a及b可發現，同樣是蠶的頭部，入光方式的不同造成衍射峰的形狀區別很大。該現象可能是由蠶頭部軀殼的衍射或對X射線的吸收所引起的。由于無法對蠶頭部軀殼單獨制樣實驗，尚不能確定具體影響大小。由上述分析可知，衍射曲線上標示的具體峰位與silkⅡ或silkⅠ結構的衍射峰位十分接近，因此可認為這些衍射峰與絲素蛋白晶體結構相關的可能性更大。另外，圖4中蠶頭部的二維衍射圖均為同心圓環狀，說明此時在吐絲口中的初生纖維中，結晶區沒有明顯取向，這是由于纖維尚未經過蠶頭部的扭動拉伸。

圖4 活蠶的WAXD二維圖譜Fig.4 2－D WAXD patterns of silkworm

2.2 絲素蛋白在濕態腺體不同部位中的有序態結構

圖6為濕態腺體各區段的WAXD一維圖譜，其中，圖6a中的腺體有表皮，圖6b中的腺體被剝除表皮。對于有表皮的濕態腺體，P、MPP只在11.5°處出現1組平緩的衍射峰，通常被認為此與絲素蛋白無定型結構相關；MPA、MMP、MMA、MAP出現兩組衍射峰，除在11.5°處出現與之前類似的衍射峰外，還分別在27.0°、27.3°及26.9°處出現1組衍射峰。這組衍射峰的峰位接近或等于27.3°，可能與silkⅡ結晶結構中晶面間距為0.326nm的［012］或［220］晶面的衍射有關。而且，腺體在接近中部腺體前區的MAP的過程中，該峰位有逐漸接近27.3°的趨勢。這說明腺體中的silkⅡ結構有可能在向前部絲腺流動的過程中逐漸形成。另外，如圖7所示，水的衍射峰的峰位大約在28.0°附近，因此該組衍射峰還可能與腺體中水的含量有關。腺體中較高的水含量，可能導致27°附近衍射峰的峰強變大。對于去表皮的濕態腺體（圖6b），結果與有表皮的濕態腺體基本相似。從圖6a中還可看出，與帶皮腺體的其他區段相比，P、MPP、MAA、A區段在11.5°附近的無定形結構的衍射峰較明顯，而在27.3°附近出現的衍射峰強度較弱或不存在，這可能與該部分腺體的直徑較小、表皮所占比例較大、絲素水溶液所占比例較少有關。其中，A區段中絲素溶液的濃度最高，腺體直徑最小，卻在27.3°附近出現的衍射峰強度較P、MPP、MAA稍強，因此可能與P、MPP、MAA中silkⅡ結構尚未明顯形成有關。

圖5 活蠶不同部位的WAXD一維圖譜Fig.5 1－D WAXD patterns of different parts of silkworm

圖6 濕態腺體各區段的WAXD一維圖譜Fig.6 1－D WAXD of different divisions of wet silk gland

2.3 干燥過程對腺體中絲素蛋白有序態結構的影響

為了研究水分流失對絲素蛋白晶體結構轉變的影響，對不同干燥時間的去表皮濕態腺體進行了同步輻射WAXD測試。圖7為MA、MM干燥過程的測試結果，圖中可明顯觀察到干燥過程中衍射峰位置發生了明顯變化。對于MA（圖7a），從初始干燥階段的衍射峰可看出其含有無定形結構，與前述濕態腺體的測試結果相符。隨著水分減少，位于28.0°處的水的衍射峰強度逐漸減弱直至消失，其2θ值也隨之減小。干燥完成后，位于11.5°處的平緩衍射峰消失，而在11.9°處出現尖峰，其數值與晶面間距為0.72nm的silkⅠ的衍射峰相近（12.3°）。另外，在19.7°處出現了1組與silkⅡ結構相關的晶面間距為0.45nm的［200］晶面的衍射峰，同時在27.8°處出現1組肩峰，接近于晶面間距為0.326nm 的［012］或［220］晶面的衍射峰（27.3°）。而 MM（圖7b）與 MA干燥過程的變化基本相似，但干燥完成時間遠長于MA。由于MA比MM更接近于吐絲口，因此MA處紡絲液的組成也更接近于吐絲口處紡絲液的組成（如pH降低且更接近絲素蛋白的等電點）。而紡絲液從吐絲口處噴出時可迅速固化，因此MA處紡絲液的固化速度也較快。

圖7 水及中部腺體在不同干燥時間的WAXD一維圖譜Fig.7 1－D WAXD of water and the middle division of silk gland at different drying time

從上述結果可看出，濕態腺體在干燥過程中，絲素蛋白中水分流失而固化，同時絲蛋白構象發生變化。水的衍射峰逐漸減弱乃至消失，而與silkⅠ、silkⅡ晶體結構有關的衍射峰逐漸增多。絲素蛋白構象從無定形結構逐漸失水轉變成交替堆積的α－螺旋和／或β－平行折疊構象趨于由β－反平行折疊形成完整的silkⅡ層狀晶體結構。另外，對中部腺體干燥前后的二維衍射圖譜（圖8）進行對比發現，干燥后的圖譜為同心圓環，這說明水分的流失可誘導絲素蛋白結晶，但結晶區并未發生明顯取向，蠶絲中的晶區取向可能是在蠶吐絲后經過頭部的扭動拉伸而誘導形成的。

圖8 中部腺體在不同干燥時間的WAXD二維圖譜Fig.8 2－D WAXD of the middle division of silk gland at different drying time

2.4 中部絲腺在拉伸過程中有序態結構的演化

為了研究拉伸對腺體有序態結構的影響，對腺體進行勻速拉伸并結合SR－WAXD進行測試（圖9）。從圖9a中可發現，拉伸速度為17.4μm／s時，隨著拉伸倍率（拉伸位移與腺體原長的比值）的增加，水的衍射峰（28.1°）強度逐漸減少，乃至消失；在38.6°處出現的弱峰，其數值與晶面間距為0.231nm的［003］晶面的衍射峰相近（39.0°），衍射強度發生小幅增強。當拉伸倍率達0.7時，在22.6°附近出現1組與silkⅡ結構相關的［002］晶面的肩峰，其強度也逐漸增強。拉伸倍率達1.0時，在9.2°、24.9°處附近出現兩組衍射峰，其中2θ＝9.2°的衍射峰有可能與silkⅡ結晶結構的［010］晶面相 關，2 4.9°處較尖的衍射峰與晶面間距為0.36nm 的［201］晶面的衍射峰相近（24.5°）。而拉伸倍率達1.8時，出現在20.6°處的衍射峰是silkⅡ的［020］晶面的衍射峰。從圖9b可發現，拉伸速度為29.0μm／s時，各衍射曲線與圖9a有相似的變化趨勢。不同之處在于：當拉伸倍率達1.5時，在21.5°、23.8°及41.9°處出現的峰位均接近脫膠絲的衍射峰；出現在27.2°處的衍射峰，與silkⅡ晶體結構的［012］或［220］晶面的衍射峰有關（27.3°）。對于37°左右的尖峰，與文獻中silkⅠ和silkⅡ結構的衍射峰不同，尚有待進一步研究。從上述結果可看出，以較慢速度拉伸腺體的過程中，腺體逐漸脫水，與silkⅡ結構相關的晶面衍射峰逐漸增多，且強度逐漸增強；當拉伸速度增大時，這種趨勢更加明顯，且衍射峰的峰位愈接近于脫膠絲的峰位。這說明拉伸是絲素蛋白成纖的主要誘導因素，并使絲素蛋白向silkⅡ結構轉變。另外，將中部腺體不同拉伸倍率下的二維衍射圖譜與脫膠絲（圖10）進行對比發現，脫膠絲的衍射圖譜中可觀察到明顯的衍射光斑，而1.8倍拉伸后的中部腺體并未發現明顯的光斑，說明中部腺體被拉伸1.8倍時，結晶區并不會因拉伸而有明顯取向。而蠶在紡絲過程中，遠大于1.8的拉伸倍率導致脫膠絲有明顯的取向結構。

圖9 脫膠絲（DS）及中部腺體中區（MM）在不同拉伸速度及拉伸倍率下的WAXD一維圖譜Fig.9 1－D WAXD of degummed silk and the middle division of silk gland at different drawing rates and drawing ratios

圖10 脫膠絲及中部腺體中區（MM）在不同拉伸倍率下的WAXD二維圖譜Fig.10 2－D WAXD of degummed silk and the middle division of silk gland at different drawing ratios

3 結論

絲素蛋白在五齡熟蠶頭部吐絲口處形成與silkⅠ、silkⅡ晶體相關的結構；絲腺內水分流失誘導絲素蛋白形成有序態結構，濕態腺體在干燥過程中，其構象轉變成β－反平行折疊并趨于形成完整的silkⅡ層狀晶體結構；拉伸作用為絲素蛋白成纖化的主要影響因素，可誘導絲素蛋白形成silkⅡ晶體結構。

［1］KERKAM K，VINEY C，KAPLAN D，et al.Liquid crystallininity of natural silk secretions［J］.Nature，1991，349：596－598.

［2］VINEY C.Light－microscopy of self－assembling biological macromolecules［J］.Am Chem Soc，Div Polym Chem，1992，33（1）：757.

［3］MAGOSHI J，MAGOSHI Y，NAKAMURA S.Crystallization，liquid crystal，and fiber formation of silk fibroin［J］.J Appl Polym Sci：Appl Polym Symp，1985，41：187－204.

［4］JIN H J，KAPLAN D L.Mechanism of silk processing in insects and spiders［J］.Nature，2003，424（6952）：1 057－1 061.

［5］李光憲，于同隱.絲蛋白纖維化機理（Ⅰ）［J］.科學通報，1989，21：1 656－1 659.LI Guangxian，YU Tongyin.The fibrillization mechanism of silk fibroin（Ⅰ）［J］.Chinese Science Bulletin，1989，21：1 656－1 659 （in Chinese）.

［6］于同隱，李光憲.絲蛋白纖維機理的模型——應力作用下絲蛋白構象的轉變［J］.高分子學報，1993，4：415－422.YU Tongyin，LI Guangxian.A model of the fibrillization mechanism of silk fibroin the conformational transition of fibroin by stretching ［J］.Acta Polymerica Sinica，1993，4：415－422 （in Chinese）.

［7］徐彭壽，潘國強.同步輻射應用基礎［M］.合肥：中國科學技術大學出版社，2009：215－216.

［8］KRASNOV I，DIDDENS I，HAUPTMANN N，et al.Mechanical properties of silk：Interplay of deformation on macroscopic and molecular length scales［J］.Phys Rev Lett，2008，100（4）：048104.

［9］MARTEL A，BURGHAMMER M，DAVIES R，et al.A microfluidic cell for studying the formation of regenerated silk by synchrotron radiation small－and wide－angle X－ray scattering［J］.Biomicrofluidics，2008，2（2）：24 104.

［10］MARTEL A，BURGHAMMER M，DAVIES R J，et al.Silk fiber assembly studied by synchrotron radiation SAXS／WAXS and raman spectroscopy［J］.J Am Chem Soc，2008，130（50）：17 070－17 074.

［11］ROSSLE M，PANINE P，URBAN V S，et al.Structural evolution of regenerated silk fibroinunder shear： Combined wide－and small－angle X－ray scattering experiments using synchrotron radiation［J］.Biopolymers，2004，74（4）：316－327.

［12］王洪，張耀鵬，邵惠麗，等.再生絲素蛋白水溶液穩定性的研究［J］.合成纖維，2004（S1）：12－14.WANG Hong，ZHANG Yaopeng，SHAO Huili，et al.The stability of regenerated silk fibroin solution［J］.Synthetic Fiber in China，2004（S1）：12－14（in Chinese）.

［13］DRUMMY L F，PHILLIPS D M，STONE M O，et al.Thermally induced alpha－helix to beta－sheet transition in regenerated silk fibers and films［J］.Biomacromolecules，2005，6（6）：3 328－3 333.

［14］LOTZ B，COLONNA C F.The chemical structure and the crystalline structures ofBombyx morisilk fibroin［J］.Biochimie，1979，61（2）：205－14.

［15］FOSSEY S A，NEMETHY G，GIBSON K D，et al.Conformational energy studies of beta－sheets of model silk fibroin peptides：Ⅰ.Sheets of poly（Ala－Gly）chains［J］.Biopolymers，1991，31（13）：1 529－1 541.

［16］ASAKURA T，ASHIDA J，YAMANE T，et al.A repeated beta－turn structure in poly（Ala－Gly）as a model for silkⅠ ofBombyxmorisilk fibroin studied with two－dimensional spin－diffusion NMR under off magic angle spinning and rotational echo double resonance［J］.Journal of Molecular Biology，2001，306（2）：291－305.

［17］ASAKURA T，OHGO K，KOMATSU K，et al.Refinement of repeated beta－turn structure for silkⅠconformation ofBombyxmorisilk fibroin using C－13solid－state NMR and X－ray diffraction methods［J］.Macromolecules，2005，38（17）：7 397－7 403.

［18］UM I C，KI C S，KWEON H Y，et al.Wet spinning of silk polymer：Ⅱ.Effect of drawing on the structural characteristics and properties of filament［J］.Int J Biol Macromol，2004，34（1－2）：107－119.

［19］SHEN Y，JOHNSON M A，MARTIN D C.Microstructural characterization ofBombyxmorisilk fibers［J］.Macromolecules，1998，31（25）：8 857－8 864.