麻黃化學拆分組分的性味藥理學評價——化學拆分組分的制備及其解熱作用的研究

王艷宏，王秋紅，夏永剛，匡海學

(黑龍江中醫藥大學北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室、黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥藥性理論是中藥理論體系的核心，也是中藥學的特色。如何做到既能闡明中藥性味理論的科學內涵，又能保持和發揚中醫藥自身的特色優勢，一直是中醫藥學者面臨的艱巨任務和巨大挑戰。遵循中醫藥學基本理論，本課題組提出了“中藥一味一性，一藥X味Y性(Y≤X)”的假說和基于中藥性味可拆分性和可組合性的研究思路，并構建了中藥性味理論研究的新模式［1－2］。

麻黃為草麻黃(Ephedra sinica Stapf)、中麻黃(Ephedra Intermedia Schrenk et C.A.Mey.)或木賊麻黃(Ephedra equisetina Bge.)的干燥草質莖，辛、微苦，溫。具有發汗散寒，宣肺平喘，利水消腫的功效［3］。為了闡明麻黃辛味和苦味的物質基礎，我們采用與麻黃性味功效相關的解熱、發汗、利尿、平喘、免疫抑制等復合藥理學指標作為麻黃性味藥理學評價系統，對麻黃的各化學拆分組分的生物學效應進行了研究。文章報道了麻黃化學拆分組分的制備方法及其對干酵母致熱作用的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，體質量(180～220)g，合格證號為P00102004，黑龍江中醫藥大學安全評價中心提供。

1.2 儀器

2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司);冷凍干燥機GLZY－0.5B(上海浦東冷凍干燥設備有限公司);OMRON電子體溫計MC－670(歐姆龍有限公司)。

1.3 藥品及試劑

麻黃藥材購自山西大同藥材公司，經黑龍江中醫藥大學中藥資源學教研室王振月教授鑒定為麻黃科植物草麻黃(Ephedra sinica Stapf)的干燥草質莖，符合《中國藥典》2010年版有關規定。732型陽離子交換樹脂、717型陰離子交換樹脂(天津光復精細化工研究所);AB－8型大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司);安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)。

2 方法

2.1 麻黃性味物質基礎的拆分研究

2.1.1 麻黃性味物質基礎的拆分方法

采用水蒸氣蒸餾法，獲得揮發油組分。多糖組分的拆分:蒸餾后的水溶液濃縮至0.5g/mL(以生藥量計)，通過AB－8大孔吸附樹脂柱色譜(上樣量為1g麻黃:5mL濕樹脂)，依次用5BV水、30%乙醇、95%乙醇洗脫，收集相應的洗脫液。95%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，獲得95%乙醇洗脫部分。水洗脫液，減壓濃縮至0.5g/mL(以生藥量計)，加95%乙醇，使含醇量達80%，靜置24h，離心，用80%乙醇多次洗滌沉淀至洗滌液三氯化鋁、三氯化鐵紙片反應均呈陰性，沉淀冷凍干燥后，即得多糖組分。將醇沉上清液與30%乙醇洗脫液合并，減壓回收至無醇味，加水調節至5×10－3g/mL(以生藥量計)，用濃鹽酸調至pH值=2，通過732型陽離子交換樹脂，隨行采用茚三酮、改良碘化鉍鉀試液TLC法檢測流出液。交換完全后，樹脂水洗至中性，取出，空氣干燥。將干燥的樹脂用氨水，乙醚進行連續回流提取，至提取液茚三酮紙片反應陰性，減壓回收溶劑至干，即得生物堿組分。將732型陽離子交換樹脂的流出液，通過AB－8大孔吸附樹脂柱色譜(上樣量為1g麻黃:5mL濕樹脂)，依次用5BV水、30%乙醇洗脫，收集相應的洗脫液。水洗脫部分，繼續通過陰離子交換樹脂，流出液及30%乙醇洗脫液分別減壓回收溶劑，冷凍干燥后與上述獲得95%乙醇洗脫部分合并，即得酚酸組分。

2.1.2 麻黃各化學拆分組分的指紋圖譜測定

為評價麻黃性味物質基礎的拆分方法的合理性、穩定性、重現性，本文對生物堿組分和酚酸組分別進行了HPLC指紋圖譜研究。

2.1.2.1 生物堿組分HPLC指紋圖譜的建立 色譜條件:Waters公司2695型高效液相色譜儀，2996型檢測器，Empower工作站;色譜柱為Diamonsil(TM)鉆石C18(5μm，250mm ×4.6mm);流速為 1.0mL/min;柱溫為25℃;檢測波長為210nm;流動相的梯度洗脫表見Tab.1。

2.1.2.2 酚酸組分HPLC指紋圖譜的建立 色譜條件:Waters公司2695型高效液相色譜儀，2996型檢測器，Empower工作站;色譜柱為 PAK C18色譜柱(4.6mmI.D ×250mm);流速為 1.0mL/min;柱溫為25℃;檢測波長為270nm;流動相的梯度洗脫表見Tab.2。

Tab.1 Gradient elution table of alkaloid

Tab.2 Gradient elution table of phenolic acid

2.1.3 麻黃化學拆分組分的化學成分互不交叉性研究

由于揮發油組分和多糖組分與其他化學拆分組分化學成分交叉的可能性較小，所以，分別采用生物堿組分和酚酸組分的TLC法、HPLC法分析條件，對麻黃各化學拆分組分化學成分的互不交叉性進行了研究。

TLC法:1)以硅膠G薄層，三氯甲烷－甲醇(5∶1)上行展開，茚三酮、硫酸乙醇、三氯化鋁、三氯化鐵溶液顯色。2)以聚酰胺薄膜，甲醇－水(4∶1)上行展開，以三氯化鋁、三氯化鐵顯色。

HPLC 法:色譜條件同 2.1.2。

2.2 麻黃各化學拆分組分對干酵母致熱作用的影響

取體質量180～220g的雄性Wistar大鼠70只，于實驗前置于實驗室(環境溫度26℃，相對濕度60%)適應環境，并每日測定其肛內溫度2～3次。按體質量及基礎體溫隨機分為7組，分別為水煎液組、揮發油組、生物堿組、多糖組、酚酸組、模型對照組、空白對照組。

大鼠于實驗前8～10h開始禁食但不禁水，實驗當日每小時測體溫1次，連續2～3次，取平均值為正常體溫。選取體溫變化不超過0.3℃的動物供實驗用。除空白對照組外，模型對照組和各藥物組大鼠每只從背部皮下注射20%安琪高活性干酵母混懸液5.0mL/kg。給致熱劑5h后，各組均灌胃給藥，水煎液給藥劑量按人和大鼠3倍等效劑量折算給予實驗動物，各化學拆分組分按其在生藥中含量同等劑量給予實驗動物，給藥體積為1.0mL/100g，模型對照組和空白對照組灌胃給予等體積蒸餾水。然后于給藥后1h、2h、4h、6h測量肛溫。試驗結果以實測值表示。

3 結果

3.1 麻黃性味物質基礎的拆分研究

取麻黃1kg，按照麻黃性味物質基礎拆分的工藝拆，獲得揮發油組分0.5mL、生物堿組分10.0g、多糖組分58.9g、酚酸組分47.0g。

所建立的生物堿組分的HPLC指紋圖譜，相似度在0.99以上，精密度、穩定性良好;共確定8個共有峰，主要為麻黃堿、甲基麻黃堿等生物堿類化合物。

所建立的酚酸組分的HPLC指紋圖譜，相似度在0.98以上，精密度、穩定性良好;共確定13個共有峰，主要為黃酮類化合物和鞣質等酚酸類化合物。

TLC法檢識結果:以茚三酮、碘化鉍鉀顯色，生物堿組分分別顯紫色和橘黃色斑點，其余各化學拆分組分均不顯色;以三氯化鋁顯色，在紫外燈下檢識，酚酸組分為黃色熒光斑點，以三氯化鐵顯色，酚酸組分為所顯斑點為綠黑色，其余各化學拆分組分均不顯色。

HPLC法分析結果:以生物堿組分的HPLC指紋圖譜條件分析，多糖和酚酸組分無與生物堿組分相應的色譜峰;以酚酸組分的HPLC指紋圖譜條件分析，生物堿和多糖組分無與酚酸組分相應的色譜峰。

3.2 麻黃化學拆分組分對干酵母致熱作用的影響實驗結果見Tab.3。

Tab.3Effects of Ephedra and its components separated by drug property on the fever by yeast(±s，n=10)

Tab.3Effects of Ephedra and its components separated by drug property on the fever by yeast(±s，n=10)

注:Compared with the model group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

body temperature change(℃)normal After yeast After drug(min)1h 2h 4h 6h Control 1ml 37.44 ±0.67 37.43 ±0.43＊＊ 37.5 ±0.39＊＊ 37.58 ±0.38＊＊ 37.3 ±0.44＊＊ 37.51 ±0.54 Group Dosagemg(100g)＊＊Model 1ml 37.30 ±0.63 39.26 ±0.49 39.72 ±0.38 39.76 ±0.38 39.87 ±0.33 39.64 ±0.51 Water－decocted 270 37.37 ±0.63 39.16 ±0.40 39.43 ±0.49 39.80 ±0.37 39.88 ±0.39 39.20 ±0.45*Alkaloid 2.7 37.17 ±0.64 39.15 ±0.44 39.50 ±0.53 39.90 ±0.45 39.99 ±0.38 39.08 ±0.61*Volatile oil 1.35 ×10 －4ml 37.27 ±0.67 39.16 ±0.47 39.55 ±0.51 39.65 ±0.31 40.08 ±0.38 39.26 ±0.30*polysaccharide 15.9 37.31 ±0.66 39.21 ±0.49 39.54 ±0.22 39.64 ±0.28 39.67 ±0.26 39.50 ±0.35 phenolic acid 12.7 37.34 ±0.66 39.38 ±0.60 39.73 ±0.32 39.80 ±0.36 39.84 ±0.23 39.22 ±0.43*

由Tab.1中數據可知，模型對照組和各藥物組皮下注射酵母混懸液5h后，體溫升高均在0.8℃以上，而空白對照組體溫幾乎沒有變化，表明酵母混懸液已制備出實驗性大鼠發熱模型。在試驗觀察的給藥后6h內，模型對照組的體溫升高持續存在，與空白對照組比較差異非常顯著(P＜0.01)，進一步說明酵母制備出的實驗性大鼠發熱模型穩定可靠。各實驗組給藥后6h，水煎液組、生物堿組、揮發油組及酚酸組與模型對照組比較有解熱作用(P＜0.05)，多糖組解熱作用不明顯(P＞0.05)。

4 討論

4.1 麻黃性味物質基礎拆分方法的建立

由于對中藥有效成分的研究存在著大量遺漏，即使是被認為無效的成分，多數也不能確定其是否真正無效;另外，很多化學成分的藥理作用非常顯著，在其它組分中即使有微量的殘留，也會有顯著的藥理作用，從而導致各拆分組分的性味歸屬出現偏差;同時，某些化學成分的穩定性和活性會受到酸堿等外界條件的影響，所以麻黃性味物質基礎拆分方法建立的原則為開展全成分拆分，且各拆分組分之間成分應盡量無交叉和保持原型狀態。

根據文獻報道及預試驗結果得知，麻黃中化學成分構成主要為揮發油、生物堿、鞣質、黃酮、多糖等成分，考慮中醫臨床用藥主要為水煎液的傳統，故采用雙提法、醇沉法、大孔吸附樹脂和離子交換樹脂等方法和技術聯合應用，實現性味物質基礎的拆分，通過應用雙提法可以獲得揮發油組分和水提液，將水提液醇沉后可以獲得多糖組分，上清液回收乙醇后，采用離子交換樹脂技術獲得生物堿組分，進而使用大孔吸附樹脂獲得酚酸組分。

為進一步給本文所建立的麻黃性味物質基礎拆分方法提供科學依據，課題組首先建立了生物堿和酚酸組分的HPLC指紋圖譜，以評價拆分方法的合理性、穩定性和重現性;進而又分別采用TLC、HPLC法進行了各化學拆分組分化學成分的互不交叉確證試驗。結果表明，該拆分方法為全成分拆分，各組分成分之間互不交叉，且盡量保持了化學成分的原型;其中生物堿組分主要為麻黃堿等生物堿;酚酸組分主要為黃酮和鞣質類化合物;揮發油組分主要為萜類和芳香族化合物;醇沉組分主要為多糖等成分［4］。本文研究工作中建立的拆分方法，具有科學性、穩定性和重現性，可以為開展同類研究提供借鑒。

4.2 麻黃的解熱作用評價

歷代本草關于麻黃具有解熱作用的記載，《本經》:“溫瘧，發表出汗，去邪熱氣”;《藥性論》:“主壯熱，解肌發表”;《日華子本草》:“退熱，御山嵐瘴氣”;《湯液本草》:“散表寒，發浮熱也”;《本草崇原》:“溫瘧發表出汗，去邪熱氣者，謂溫瘧病藏于腎，麻黃能起水氣而周遍于皮毛，故主發表出汗，而去溫瘧邪熱之氣也”;《本草經解》:“溫瘧，但熱不寒之瘧也，溫瘧而頭痛，則陽邪在上，必發表出汗，乃可去溫瘧邪熱之氣，所以亦可主以麻黃也”。通過這些論述可以得知麻黃具有解熱作用，且可能源于其具有發汗作用，也可能由于其具有“御山嵐瘴氣”的作用?，F代對麻黃開展解熱作用研究的報道較少。本結果表明，麻黃具有一定的解熱作用，但發揮作用較緩慢，且作用微弱。

4.3 麻黃發揮解熱作用的物質基礎為生物堿組分、揮發油組分及酚酸組分

關于麻黃生物堿、非麻黃堿組分的解熱作用，文獻報道較少。關于麻黃揮發油的解熱作用則有文獻報道，如麻黃揮發油乳劑對人工發熱的兔具有解熱作用，麻黃揮發油及萜松醇對正常小鼠體溫有降溫作用，以萜松醇作用更為明顯。本研究結果表明，麻黃生物堿、揮發油、非生物堿組分均具有解熱作用，是其發揮解熱作用的物質基礎。多糖組分無解熱作用，應該與生物堿組分等分屬于不同性味的物質基礎。

［1］ 匡海學，程偉.中藥性味的可拆分、可組合性研究［J］.世界科學技術 －中醫藥現代化，2009，11(6):768－771.

［2］ 匡海學，王艷宏，王秋紅，等.基于中藥性味可拆分性和可組合性的中藥性味理論研究新模式［J］.世界科學技術－中醫藥現代化，2010，12(6):1 －5.

［3］ 楊繼榮，王艷宏，關楓.麻黃本草考證概覽［J］.中醫藥學報，2010，38(2):51－52.

［4］ 夏永剛，梁軍，楊炳友，等.麻黃多糖中糖醛酸含量的測定［J］.中醫藥學報，2011，39(1):71 －73.