攜帶紅色熒光蛋白報告基因的重組腺病毒載體的構建及其體外試驗研究*

盧建溪， 陽 莉， 錢師宇， 王 強

(1中山大學附屬第三醫院疫苗研究所，廣東廣州510630;2暨南大學醫學院，廣東廣州510632)

報告基因是指一組編碼易被檢測的蛋白質或酶的基因，可通過報告基因的表達產物來“報告”目的基因的表達調控，作為一種靈敏度高、檢測簡便、結果可靠的技術手段，已廣泛應用于基因表達調控、細胞信號轉導、示蹤等分子生物學和細胞生物學研究領域。目前，用于醫學研究的熒光蛋白主要有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)兩種，但RFP的應用遠沒有GFP廣泛。RFP是1999年由Matz等[1]從珊瑚蟲體內分離出來的熒光蛋白，因其與GFP同源，可與GFP系列熒光蛋白共用，而且激發和發射波長更長，細胞內成像背景低，而被迅速關注。RFP對GFP是一種很好的代替和補充，為細胞內基因表達多熒光標記提供了更多的熒光標簽[2，3]。因此，本研究構建了攜帶紅色熒光蛋白報告基因的重組腺病毒載體，并在體外測試其對腫瘤細胞的感染效率，以期為基因治療與基因疫苗研究提供另一種檢測工具。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞與菌種 AD293細胞為本研究所保存。DH5α和Stbl2菌種購自Invitrogen。

1.2 質粒 pShuttle－CMV、pTurboRFP－N 和 pH5'040.pkGFP－II為本研究所保存。

1.3 主要試劑 DMEM培養基(Gibco);Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑(Invitrogen);特級胎牛血清(Hyclone);限制性內切酶及連接酶(TaKaRa);凝膠回收試劑盒、純化試劑盒及質粒小提試劑盒(Omega);質粒中量制備試劑盒(Qiagen)。

1.4 主要儀器 微量臺式離心機(Beckman)，核酸蛋白分析儀(Beckman)，熒光倒置顯微鏡(Nikon)，二氧化碳培養箱(Herarus)，生物安全柜(Thermo)，超低溫冰箱(Thermo)，電泳儀(上海天能科技公司)凝膠成像分析系統(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 攜帶目的基因的腺病毒穿梭質粒pShuttle－TurboRFPN的構建 用核酸內切酶Nhe I和Not I分別雙酶切攜帶目的基因RFP的質粒pTurboRFP－N和腺病毒穿梭質粒pShuttle－CMV，將酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分別回收796 bp的目的基因RFP片段和線形的腺病毒穿梭質粒pShuttle－CMV片段。用T4 DNA連接酶連接這2個片段，將純化后的連接產物轉化到超級感受態DH5α細胞中，涂布于含卡那霉素(50 mg/L)的LB平板上37℃倒置培養16 h。挑選菌落擴增，試劑盒提取質粒，用Nco I和Not I雙酶切鑒定篩選出含RFP基因的陽性克隆。

2.2 重組腺病毒載體 AdH5'.040.CMV.RFP － N 的構建用核酸內切酶I－Ceu I和PI－Sce I分別雙酶切腺病毒穿梭質粒pShuttle－TurboRFP－N和骨架質粒pH5'040.pkGFPII，將酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分別回收含RFP基因的2 040 bp片段和31 873 bp骨架大片段。用T4 DNA連接酶連接這2個片段，構成重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N，將純化后的連接產物轉化超級感受態Stbl2細胞，涂布于含氨芐青霉素(60 mg/L)的LB平板上37℃倒置培養16 h。在熒光顯微鏡下挑取無綠色熒光的菌落，經過BstXⅠ初步酶切鑒定，有1個克隆出現預期條帶，該陽性克隆再經HindⅢ和EcoRⅠ/SalⅠ酶切進一步鑒定。篩選出的陽性克隆進行質粒中量制備，取12 μg的重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP －N 用 PacⅠ酶切，使其完全線性化，暴露其反向末端重復序列(inverted terminal repeat，ITR)，用純化試劑盒純化酶切產物，置－20℃保存備用。

2.3 重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N的包裝和擴增 根據Lipofectamine 2000轉染試劑盒的使用說明，將線性化的AdH5'.040.CMV.RFP－N 轉染AD293細胞，轉染前1 d，將AD293細胞接種于6孔板中。轉染當天，換無抗生素培養基，待細胞70% －90%融合時，加入DNA/脂質體復合物，轉染后4－6 h換完全培養基(含10%FBS，1%雙抗)。在熒光顯微鏡下逐日觀察RFP表達及細胞病變情況，至AD293細胞80%出現病變時收集細胞，在37℃水浴與－80℃超低溫冰箱之間反復凍融3次，10 000×g離心10 min，收集上清即病毒液，置－80℃作為毒種保留。將上述毒種反復感染293細胞來擴增病毒，用CsCl2連續密度梯度離心法純化病毒液，透析后分裝。

2.4 重組腺病毒顆粒感染能力檢測 取上清液感染融合度達70% －90%的AD293細胞，用完全培養基培養。觀察紅色熒光蛋白表達及細胞病變情況，檢測重組病毒顆粒是否具有感染活性。

2.5 重組腺病毒的滴度測定 按Quantum公司提供的試劑盒說明書步驟，采用組織培養半數感染劑量(median tissue culture infectious dose，TCID50)法滴定重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N的生物活性及滴度。

2.6 腺病毒載體體外感染腫瘤細胞 將人肺癌細胞系A549和乳腺癌細胞系MDA－MB－231按照5×104cells/well接種于 24 孔板中，24 h后將腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N和對照病毒AdH5.CMV.EGFP按照1 000 vp/cell的劑量感染接種的細胞，37℃、5%CO2培養，48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞感染效果并照相。10×物鏡下隨機選擇3個不同視野，計算RFP和EGFP陽性細胞數及總細胞數，比較上述2種腺病毒對這2種腫瘤細胞的感染效率。本實驗重復3次。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件分析，計量資料數據以均數±標準差(±s)表示。單變量配對資料之間的比較采用配對樣本t檢驗。

結 果

1 重組腺病毒穿梭質粒pShuttle－TurboRFP－N的酶切鑒定

腺病毒穿梭質粒pShuttle－TurboRFP－N用核酸內切酶Nco I、Not I雙酶切后，經過1%瓊脂糖凝膠電泳結果可見3 817 bp和1 071 bp 2個片段，證明RFP基因成功克隆入腺病毒穿梭質粒pShuttle，見圖1。

Figure 1.Identification of the vector pShuttle－TurboRFP－N.M:marker;Lane 1:the result of pShuttle－TurboRFP－N digested with Nco I and Not I.圖1 質粒pShuttle－TurboRFP－N酶切鑒定

2 重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N酶切鑒定結果

挑取無綠色熒光克隆進行質粒小量提取，經過BstXⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定正確。EcoRⅠ酶切可見1 079 bp目的基因片段，證明成功地構建了重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N，見圖2。

3 重組病毒載體在AD293細胞中的包裝和擴增

脂質體介導線性化重組腺病毒質粒轉染AD293細胞，于轉染第2 d熒光顯微鏡下觀察可見有RFP表達，轉染后第10 d出現明顯的細胞病變。表現為明顯增大呈球形，細胞核變大、變圓、貼壁能力下降而易脫落。用AdH5'.040.CMV.RFP－N細胞裂解液感染AD293細胞，感染第2 d即可見明顯的細胞病變及RFP表達，到第7 d出現明顯病毒噬斑，說明在AD293細胞中成功包裝并擴增出具有感染性的病毒顆粒，見圖3。

Figure 2.Identification of the recombinant adenovirus vector AdH5'.040.CMV.RFP － N.M:marker;Lane 1:AdH5'.040.CMV.RFP － N was digested with EcoRⅠ;Lane 2:AdH5'.040.CMV.RFP － N was digested with BstXⅠ.圖2 重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N酶切鑒定

Figure 3.Infection of AD293 cells by the recombinant adenovirus AdH5'.040.CMV.RFP － N.A:AD293 cells;B:AD293 cells infected by primary supernatant of recombinant adenovirus AdH5'.040.CMV.RFP － N after cultured for 24 h(inverted fluorescence microscope，×200).圖3 AdH5'.040.CMV.RFP －N 感染 AD293 細胞

4 重組腺病毒的滴度測定

擴增純化后對獲得的重組腺病毒載體采用TCID50法滴定重組腺病毒載體 AdH5'.040.CMV.RFP－N，其滴度為 1×1013pfu/L。重組腺病毒顆粒數為3.6×1015vp/L。

5 腺病毒體外感染腫瘤細胞

用腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP － N(1 000 vp/cell)和對照病毒AdH5.CMV.EGFP感染人肺癌細胞系A549和乳腺癌細胞系MDA－MB－231，48 h后于倒置熒光顯微鏡下照相，10×物鏡下隨機選取3個不同視野，通過計算RFP和EGFP陽性率來比較2種腺病毒對上述腫瘤細胞系的感染效果，見圖4。經SPSS 13.0統計學軟件分析表明:在CAR受體高表達的人肺癌細胞系A549中，腺病毒AdH5'.040.CMV.RFP－N對其感染效率(80.00%±2.65%)高于對照腺病毒(59.00% ±3.61%)，見圖4A、B，P＜0.05。在 CAR低表達的乳腺癌細胞系 MDA－MB－231中，腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N對其感染效率(76.00% ±2.65%)高于對照腺病毒(51.00% ±1.73%)，見圖4C、D，P ＜0.05 。

Figure 4.Comparison of infection efficiencies between AdH5'.040.CMV.RFP － N and AdH5.CMV.EGFP.A:A549 cells infected by AdH5'.040.CMV.RFP － N;B:A549 cells infected by AdH5.CMV.EGFP;C:MDA － MB －231 cells infected by AdH5'.040.CMV.RFP－N;D:MDA－MB－231cells infected by AdH5.CMV.EGFP.圖4 腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N 和對照病毒AdH5.CMV.EGFP對腫瘤細胞感染效率的比較

討 論

腺病毒感染滴度高、既可以感染分裂期細胞又可以感染非分裂期細胞、基因容量較大、外源基因表達水平高且蛋白質磷酸化和糖基化水平高，病毒基因組較少發生重排以及具有多種型別可供選擇等優點，因此是目前基因研究普遍應用的載體[4－6]。隨著分子生物學領域的迅猛發展，特別是重組DNA技術的建立，使得導入各種目的基因成為可能。本研究使用的pShuttle用于克隆目的基因，該穿梭質粒含有極罕見的2種內切酶酶切位點 PI－SceⅠ和 I－CeuⅠ，分別位于CMV啟動子上游和PolyA尾下游，而且二者之間含有很多的克隆位點，可以方便地插入各種PCR產物或酶切產物。構建重組腺病毒時，只需將插入了外源基因的穿梭質粒用PI－SceⅠ/I－CeuⅠ雙酶切后與經過同樣酶切的腺病毒骨架質粒DNA連接，由于骨架質粒分子量較大，使其連接效率較低，這是技術上的難點。采用體外酶切連接的方法構建和制備表達RFP的重組腺病毒載體，比傳統的細胞內同源重組方法[7]更為方便快捷，可使構建階段最快1周完成，包括包裝出重組病毒顆粒也只需3周時間，極大地縮短了實驗時間，為快速高效地構建攜帶各種目的基因的重組腺病毒載體奠定了基礎。

在基因治療的研究中，評價重組腺病毒的基因轉移效率、組織分布特點等，一般通過如 β－半乳糖苷酶基因(LacZ)、GFP基因等報告基因來進行檢測和評價。目前，RFP的使用還遠沒有GFP廣泛，與GFP相比RFP有如下優點[8－10]:(1)激發和發射波長較長，具有較高的信噪比，更易檢測;(2)熒光的強度要比GFP的強度高得多;(3)對pH值不敏感，pH值為4.5－12.0時仍保持穩定。相信隨著對RFP研究的深入，其使用范圍會更加廣泛，將成為人們進行科學研究的重要工具。

本研究采用體外連接法成功地構建了攜帶RFP基因的重組腺病毒載體AdH5'.040.CMV.RFP－N，將其轉染AD293細胞后包裝出重組腺病毒顆粒，感染AD293細胞后RFP得到了高效表達。在CAR受體高表達的人肺癌細胞系A549以及在CAR低表達MDA－MB－231腫瘤細胞系中，本研究所構建的重組腺病毒AdH5'.040.CMV.RFP－N對上述2種腫瘤細胞的感染效率均高于對照腺病毒AdH5.CMV.EGFP，其原因可能是RFP的熒光的強度要比GFP的強度高得多。上述研究結果表明RFP對GFP是一種很好的代替和補充，為RFP作為報告基因在基因治療中的應用奠定了實驗基礎。

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