重組人補體受體1型SCR15－18片段對腸缺血再灌注損傷的保護作用*

汪曉艷， 劉高科， 何 莉， 汪正清△

(1第三軍醫大學基礎部微生物教研室，重慶400038;2重慶市結核病防治所，重慶400050)

腸道黏膜免疫屏障在防御細菌及毒素等入侵時起重要作用。嚴重創傷、感染及休克可導致腸缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion，I/R)，使腸內細菌和毒素移位，引起腸源性感染和炎癥損傷，嚴重者可導致全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1，2]。腸缺血/再灌注損傷的發生機制和防治是亟待解決的問題。腸I/R損傷的發生機制比較復雜，近年來的研究證明，補體系統被過度激活而產生的C4a、C3a、C5a及C5b－9炎癥效應片段在介導腸I/R損傷的發生發展中起著非常重要的作用[2－5]。動物實驗證明，C3a、C5a的抗體和C5aR拮抗劑可減輕腸I/R損傷，但保護效果很不完全。目前國內外研究的重點多放在補體激活途徑的始動環節上。抑制補體系統過度活化，以減少過量炎癥效應片段生成。本室已經在畢赤酵母中成功克隆表達具有結合C3b并抑制C3/C5轉化酶生物活性作用的人補體受體1型(complement receptor type 1，CR1)片段 SCR15 －18[6]，本實驗采用大鼠腸I/R模型，探討CR1－SCR15－18蛋白對腸I/R損傷的保護效應，為防治腸I/R損傷開辟新途徑提供實驗數據。

材料和方法

1 材料

蛋白CR1－SCR15－18按文獻[6]制備，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，小鼠抗人C3抗體購自Santa Cruz，免疫組化SP法染色試劑盒購自中衫公司，伊文氏藍染料購自Sigma。其它試劑均為進口分裝或國產分析純。

2 方法

2.1 實驗分組及動物模型的建立 隨機將健康雄性(230±20)g SD大鼠(由第三軍醫大學實驗動物中心提供)分為3組:(1)假手術組(SO)15只:開腹，分離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)不夾閉;(2)缺血再灌注組(I/R)15只:腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后仰臥位固定，消毒后行剖腹術。分離SMA，在其根部用無創傷微血管夾夾閉，參考文獻[7]缺血30 min后，移除血管夾，再灌注60 min，根據缺血小腸動脈分支搏動和小腸顏色的變化判斷缺血或再灌注是否成功;(3)CR1－SCR15－18保護組(CR1)15只:參考文獻[7]缺血30 min，再灌注60 min，在再灌注前5 min，腿靜脈注射蛋白CR1－SCR15－18(30mg/kg，PBS溶解，濃度1%)。3組大鼠術前均禁食12 h，自由飲水。

2.2 觀察指標

①血管通透性檢測 根據滲入到組織中的伊文氏藍染料的量來評價血管的通過性[8]。再灌注前2 min，Evan blue(20 mg/kg)通過大腿靜脈注射(1 mL/kg)。再灌結束后取回盲部10 cm以上腸管約5 cm，剪開，37℃干燥24 h，稱重后用3 mL甲酰胺室溫浸泡24 h提取伊文氏藍。620 nm處繪制伊文氏藍的標準曲線，讀取提取液中的A值，計算組織中伊文氏藍的量，結果用“(伊文氏藍)μg/g(組織)”表示。

②MPO、SOD活性及MDA含量測定 取小腸回盲部10 cm以上腸管，冰生理鹽水洗凈，吸干，－70℃凍存。MPO、SOD和MDA的測定按試劑盒說明書操作。

③組織病變觀察 取小腸回盲部10 cm以上腸管，中性甲醛固定。常規石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察病變。小腸損傷程度分級評分參考Chiu分級標準[9]。

④免疫組化檢測補體C3原位沉積 石蠟切片后，免疫組化染色采用SP法，待測抗原為補體組分C3，Ⅰ抗為小鼠抗人C3(1∶600稀釋)，Ⅱ抗為山羊抗小鼠IgG，DAB顯色，蘇木素復染。

3 統計學處理

結 果

1 血管通透性的變化

缺血再灌注后，小腸血管通透性發生了改變，I/R組滲透到小腸組織伊文氏藍染料的量高于SO組(P＜0.01);與I/R組比較，CR1組滲透到小腸組織伊文氏藍染料的量明顯降低(P＜0.01)，見表1。

表1 滲透到各組大鼠小腸組織中伊文氏藍染料量的比較Table 1.Comparison of the amount of Evans blue dye penetration into the intestinal tissues of rats(±s.n=4)

表1 滲透到各組大鼠小腸組織中伊文氏藍染料量的比較Table 1.Comparison of the amount of Evans blue dye penetration into the intestinal tissues of rats(±s.n=4)

＊＊P ＜0.01 vs SO group;△△P ＜0.01 vs I/R group.

Group Evans blue(μg/g)SO 118.54 ±15.36 I/R 393.08 ±36.39＊＊CR1 183.24 ±31.08△△

2 腸組織MPO、SOD和MDA的變化

與SO組相比，I/R組小腸組織中MPO活性和MDA的量均顯著升高(P＜0.01)，SOD活性降低(P＜0.01);CR1組的小腸中MPO活性和MDA的量均低于I/R組(P＜0.01)，SOD活性高于I/R組(P＜0.05)，見表2。

3 免疫組化結果

與SO組相比，I/R組腸缺血壞死區補體組分C3在小腸損傷的絨毛頂端和固有層部位大量沉積，CR1保護組只有少量的補體組分C3在固有層沉積，見圖1。

表2 各組大鼠小腸組織中SOD、MDA和MPO水平的比較Table 2.Comparison of SOD，MDA and MPO in rat intestinal tissues in different groups(±s.n=8)

表2 各組大鼠小腸組織中SOD、MDA和MPO水平的比較Table 2.Comparison of SOD，MDA and MPO in rat intestinal tissues in different groups(±s.n=8)

*P ＜0.01，＊＊ P ＜0.05 vs SO group;△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs I/R group.

Group SOD(103U/g) MDA(μmol/g) MPO(U/g)SO 62.35 ±6.74 1.30±0.10 0.39±0.08 I/R 48.88±4.38＊＊ 1.93±0.15＊＊ 0.73±0.09＊＊CR1 55.91±7.99△ 1.46±0.09＊△△ 0.45±0.09△△

Figure 1.C3 deposition in the intestinal tissues detected by immunohistochemistry(×400).A:sham operation(SO)group;B:I/R group;C:CR1 SCR－15－18 treatment group.圖1 大鼠小腸組織C3免疫組織化學染色

4 小腸組織病理學改變

圖2顯示，光鏡下SO組腸黏膜絨毛完整，無損傷;I/R組大鼠腸黏膜頂端上皮大片壞死，脫落，大量炎癥細胞浸潤、黏膜固有層水腫、瘀血、細胞構成增多，靠近頂端的固有層絨毛出血和潰瘍;CR1保護組組織損傷程度明顯減輕，僅部分頂端上皮崩解脫落和輕度淤血。且CR1保護組損傷評分低于I/R組(P ＜0.05)。

Figure 2.The pathological changes of the intestinal tissues of rats(HE staining，×200).A:sham operation(SO)group;B:I/R group;C:CR1 SCR－15－18 treatment group.圖2 大鼠小腸組織病理變化

討 論

補體系統是天然免疫和獲得性免疫的重要組成部分，具有抗微生物感染、免疫調節等多種作用。但在腸缺血再灌注等疾病中，補體過度活化[2，10]并產生大量的 C3a、C5a和 C5b－9攻膜復合體(membrane attack complex，MAC)，直接或間接介導無菌性炎癥反應而加重組織損傷。因此，研發有效的補體抑制劑，抑制補體活化已成為防治腸缺血再灌注損傷的重要策略，也是臨床上為防治諸多由補體過度活化所致疾病亟待解決的問題。

CR1為體內重要的補體調節因子，由30個短同源重復序列(short consensus repeats，SCR)構成，擁有3個活性位點，分別為位點I和2個拷貝的位點II[11]。其中位點 I位于 SCR1 －3，能結合 C4b，加速C3/C5轉化酶的衰變，基于位點I研制的補體抑制劑APT070具有良好的抑制補體活化功能;2個拷貝的位點II分別位于SCR8－10和SCR15－17，均能結合C3b/C4b，抑制C3/C5轉化酶的形成，輔助I因子裂解C3b/C4b，阻斷C3a、C5a及 MAC的產生，具有抗補體治療的潛在應用價值。在前期工作中，我們已在畢赤酵母中分泌表達出具有抑制補體活化功能的CR1－SCR15－18蛋白[6]。本研究用蛋白 CR1－SCR15－18進行腸I/R的保護性實驗，觀察CR1－SCR15－18能否抑制補體活化，減輕組織損傷。

腸缺血再灌注后補體系統經經典、旁路和甘露聚糖結合凝集素(mannose－binding lectin，MBL)途徑不同程度地被激活[5]。C3位于3條激活途徑的匯合點，在補體系統激活過程中起著樞紐作用[12]，因此用免疫組化檢測缺血再灌注部位的補體組分C3的沉積，能反應補體活化的程度。對比I/R組和SO組免疫組化檢測補體C3的結果發現(圖1)，I/R組腸黏膜缺血壞死區中有大量補體C3組分的沉積，這說明腸缺血再灌注時，損傷部位補體過度活化，而C3在CR1保護組的沉積明顯少于I/R組，說明CR1－SCR15－18蛋白能夠有效抑制腸I/R時補體的活化。本研究發現，小腸缺血30 min，再灌注60 min導致嚴重腸黏膜壞死，脫落，黏膜固有層瘀血水腫，大量炎癥細胞浸潤，病理損傷嚴重，反映組織脂質過氧化程度的檢測指標MDA含量升高，反映組織超氧陰離子多少的指標SOD活性下降，同時滲透到I/R組腸組織中伊文氏藍的量和MPO活性的明顯增高。而滲透到組織中伊文氏藍的量間接反映了血管通透性的改變，MPO活性可反映組織中性粒細胞的聚集浸潤程度和炎癥程度。所以，以上結果說明由補體活化引起的血管通透性改變和中性粒細胞的活化是導致腸I/R損傷的重要原因。補體活化時即可通過C4a、C3a和C5a激活白細胞釋放組胺等炎癥介質使平滑肌收縮，MAC導致細胞發生滲透性溶解死亡，引起血管通透性的改變，致腸黏膜屏障的破壞[13]。更為嚴重的是，C3a和C5a能夠活化內皮細胞和中性粒細胞，通過上調內皮細胞黏附分子E－選擇素、P－選擇素等的表達，介導細胞相互作用，從而引起中性粒細胞和單核巨細胞的活化、浸潤和聚集[14]，而活化的中性粒細胞可釋放大量炎癥因子介導腸I/R損傷[2]。因此，可以認為，補體在腸I/R時過度活化是導致腸I/R損傷的重要始動因素。所以，在腸I/R時，用CR1－SCR15－18蛋白抑制補體的活化，能夠減少過敏毒素C3a、C5a和MAC的產生，保護血管內皮的完整性，抑制中性粒細胞活化黏附、浸潤和聚集，繼而減輕組織的炎癥損傷。

綜上所述，補體活化是導致腸黏膜損傷的重要原因，蛋白CR1－SCR15－18通過抑制補體的活化，減少過敏毒素、MAC和炎癥介質的產生，抑制中性細胞和內皮細胞的活化，保護腸黏膜免受損傷。

[1]Nakao A，Kaczorowskil DJ，Sugimoto R，et al.Application of heme oxygenase－1，carbon monoxide and biliverdin for the prevention of intestinal ischemin/reperfusion injury[J].J Clin Biochem Nutr，2008，42(2):78 －88.

[2]Grootjans J，Lenaerts K，Derikx JP，et al.Human intestinal ischemia－ reperfusion－induced inflammation characterized:experiences from a new translational model[J].Am J Pathol，2010，176(5):2283 － 2291.

[3]Woods KM，Pope MR，Hoffman SM，et al.CR2+marginal zone B cell production of pathogenic natural antibodies is C3 independent[J].J Immunol，2011，186(3):1755 －1762.

[4]Davis AE 3rd，Lu F，Mejia P.C1 inhibitor，a multifunctional serine protease inhibitor[J].Thromb Haemost，2010，104(5):886 －893.

[5]Lee H，Green DJ，Lai L，et al.Early complement factors in the local tissue immunocomplex generated during intestinal ischemia/reperfusion injury[J].Mol Immunol，2010，47(5):972－981.

[6]劉高科，何 莉，楊永濤，等.人補體受體1型活性片段SCR15－18在畢赤酵母中的表達、純化及活性鑒定[J].第三軍醫大學學報，2009，31(6):470－473.

[7]譚 兵，蘭陽軍，張德純，等.重組人可溶性補體受體1型SCR15－18片段對心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].中華心血管病雜志，2007，35(11):1037 －1040.

[8]Souza DG，Esser D，Bradford R，et al.APT070(Mirococept)，a membrane－ localised complement inhibitor，inhibits inflammatory responses that follow intestinal ischaemia and reperfusion injury[J].Br J Pharmacol，2005，145(8):1027－1034.

[9]Chiu CJ，McArdle AH，Brown R，et al.Intestinal mucosal lesion in low － flow states.I.A morphological，hemodynamic，and metabolic reappraisal[J].Arch Surg，1970，101(4):478－483.

[10]Fleming SD，Hylton D，Hoffman S，et al.CR2 targeted complement inhibitors attenuate intestinal damage[J].Mol Immunol，2010，47(13):2277.

[11]Furtado PB，Huang CY，Ihyembe D，et al.The partly folded back solution structure arrangement of the 30 SCR domains in human complement receptor type 1(CR1)permits access to its C3b and C4b ligands[J].J Mol Biol，2008，375(1):102－118.

[12]Acosta J，Qin X，Halperin J.Complement and complement regulatory proteins as potential molecular targets for vascular diseases[J].Curr Pharm Des，2004，10(2):203－211.

[13]Diepenhorst GM，van Gulik TM，Hack CE，et al.Complement－mediated ischemia－reperfusion injury:lessons learned from animal and clinical studies[J].Ann Surg，2009，249(6):889 －899.

[14]Holers VM.The spectrum of complement alternative pathway － mediated diseases[J].Immunol Rev，2008，223:300－316.