改良IME－FICC法檢測鼻咽癌患者外周血循環腫瘤細胞及其臨床意義分析*

蔡清清， 丁 穎， 林天歆， 黃慧強△

(1中山大學腫瘤防治中心內科，廣東廣州510060;2廣東藥學院附屬第一醫院腫瘤科，廣東廣州510080;3中山大學附屬第二醫院泌尿外科，廣東廣州510120)

廣東省是全球鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)最高發的地區，目前廣東省每年的鼻咽癌新發病例約5 000例，而我院每年的收治鼻咽癌新發病例約3 000例。頸淋巴結轉移是目前判斷NPC預后的重要因素。然而，頸淋巴結轉移狀態對預后的預測準確率并不理想，部分早期患者亦可出現遠處轉移，因此亟需尋找更有效的預測指標。大量基礎和臨床研究顯示，外周血中檢測到循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是一個潛在的預后因素，并在乳腺癌中得到臨床證實[1－5]。我們既往的研究已經證實改良免疫磁珠富集及免疫熒光細胞化學方法(immunomagnetic enrichment and fluorescent immunocytochemistry，IME－FICC)檢測乳腺癌外周血中的CTCs是一種簡便、省時、敏感性及特異性均較高的方法[6，7]。本研究將改良 IME－FICC法應用于檢測NPC患者外周血中的CTCs，并探索其臨床意義。

材料和方法

1 臨床資料

2008年1月－2008年12月，共收治76例初治鼻咽癌患者。所有入選病例均被臨床檢查及組織學或細胞學確診為I－IVb期的鼻咽癌患者，分期標準按照2002年AJCC(American Joint Committee on Cancer)制定的關于腫瘤分期的標準，在抽血前均未接受任何治療。76例鼻咽癌患者的病理類型均為WHO II/III型。I期接受根治性放療，II－IVb接受含鉑類的誘導化療2－3療程，后接受根治性的聯合鉑類的同期放化療(鼻咽部66－70 Gy/6.5－7周;頸淋巴結陽性給予根治量60－70 Gy/6－7周;頸部淋巴結陰性給予預防量50－56 Gy/5－5.5周)，見表1。另取20例正常志愿者的外周血標本作為陰性對照。中位隨訪25(范圍:5 －35)個月后，有17例患者復發，13例復發部位在鼻咽和/或頸部，3例發生遠處轉移，1例鼻咽和/或頸部+遠處轉移。7例死亡，均死于腫瘤復發。

表1 76例鼻咽癌患者臨床特征Table 1.Clinical characteristics of NPC patients(n=76)

2 實驗主要試劑及儀器

2.1 主要試劑 CNE1的鼻咽癌細胞株由美國ATCC細胞庫提供。0.25%的胰酶、DMEM、胎牛血清和青霉素/鏈霉素購自 Life Technologies。Histopaque－1077購自 Sigma。

OncoQuest提供的上皮細胞回收試劑盒包括 :EpiSep玻片、免疫磁珠顆粒、生物素標記的抗細胞角蛋白(cytokeratin，CK)8/18抗體、堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素溶液、熒光懸液(含ELF－97)、DAPI、預洗緩沖液、終止緩沖液、乙醇固定劑、沖洗緩沖液、陽性對照(緩沖液中固定了的CNE1細胞)和陰性對照(緩沖液中固定了的正常供者的PBMC)。

2.2 儀器與設備 Beckman離心機，37℃、5%CO2細胞培養箱，超凈臺，低速旋轉器和熒光顯微鏡及連接顯微鏡的數碼相機和電腦。

3 方法[6，7]

3.1 共采集15 mL肝素抗凝靜脈血(留取第2管血，以防止由于靜脈穿刺把皮膚表皮細胞帶進血管中而造成的假陽性結果)。使用Histopaque－1077，利用密度梯度原理，分離單個核細胞。使用一種磁珠顆粒與抗上皮細胞黏附分子(epidermal cellular adhesion molecule，EpCAM)的抗體結合以辨認表達EpCAM的單個核細胞。取50 μL磁珠顆粒加入950 μL細胞懸液中，孵育后使用特制的EpiSep玻片(玻片中央有一個橢圓形的加樣孔，玻片被固定在磁鐵板上，磁鐵板的中央有一塊長方形磁鐵，則加樣孔在磁鐵正上方)。將混合物加到玻片的加樣孔中。表達EpCAM的陽性細胞結合到磁珠上，被磁鐵吸住。隨后，用酒精固定，加生物素標記的抗CK8/18抗體孵育，加鏈親和素－堿性磷酸酶溶液，孵育，洗滌。加熒光懸液(含ELF－97，一種酶標的熒光物質，是水溶性的，可發出弱藍熒光。被堿性磷酸酶酶解后，不溶于水，被特定波長的光照射后，可激發出強綠熒光)孵育，洗滌。最后，用DAPI孵育，熒光標記胞核的雙鏈DNA，洗滌。每次分析都使用CNE1細胞及正常人分離出的外周血單個核細胞分別作為陽性和陰性對照。

3.2 在熒光成像顯微鏡下分析CK8/18+細胞 本研究使用一部裝備100W的汞燈作光源的熒光顯微鏡(Nikon)。為了區分DAPI發出的藍熒光及ELF97酶解反應物發出的綠熒光，顯微鏡同時裝備了2個濾板，一個窄波段濾板可用于檢測DAPI發出的藍熒光;另一個寬波段濾板可用于檢測ELF97酶解反應物發出的綠熒光。移動濾板到不同位置，就可觀察到被熒光染色的核發出的藍熒光及CK8/18發出的綠熒光，并能觀察到陽性細胞的形態學特征。使用裝備在顯微鏡上的彩色數碼相機成像，經SPOT Advanced 3.4 for Windows(Diagnostic Instruments)軟件處理后，保存在計算機里。

4 病毒殼蛋白抗原(viral capsid antigen，VCAIgA)抗體滴度檢測方法

VCA－IgA免疫酶染色檢測試劑盒購自廣東中山生物工程公司。待檢血清用PBS從1∶5開始倍比稀釋，按說明書操作，以陽性結果的最低血清稀釋度作為血清內相應抗體的滴度[8]。

5 統計學處理

用SPSS 13.0軟件包對數據進行統計分析。采用Kaplan－Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用log－rank檢驗。復發與否、轉移與否、復發轉移與否組間的CK8/1818 CTCs和VCA－IgA中位數比較采用Wilcoxon秩和檢驗。CK8/18+CTCs不同水平間2年無復發率及2年生存率的比較采用Fisher精確概率法。VCA－IgA＜1∶80和≥1∶80兩組間2年無復發率和2年生存率比較采用卡方檢驗。CK 8/18+CTCs以及VCA－IgA不同水平間中位無復發時間和中位總生存時間比較采用Gehan法。無復發和生存的多因素分析采用Cox比例風險回歸模型(Forward LR)。

結 果

1 鼻咽癌患者外周血循環腫瘤細胞的形態特征

本研究使用這一檢測方法分析了76例臨床分期I－IVb期的初治鼻咽癌患者。圖1顯示了其中鼻咽癌患者外周血中的CK8/18+細胞，可見其表面覆蓋多個磁珠，在寬波段濾板，其胞漿因表達CK8/18蛋白而被染上綠熒光，而胞核(因含dsDNA而被DAPI染色)呈現強白光，在窄波段濾板，可見原胞核位置被染上藍熒光，且這一胞核較大，形狀不規則，而周圍的白細胞均未被染色。

2 檢測鼻咽癌患者外周血CK8/18+腫瘤細胞的敏感性及特異性

76例鼻咽癌患者的外周血中有63例檢測到CK8/18+細胞，陽性率為82.9%，20例正常志愿者外周血中無一例檢測到CK8/18+細胞，兩組差異顯著(P＜0.01)。本實驗方法檢測外周血CK+腫瘤細胞的特異性為100%(20/20)。

3 治療前檢測的鼻咽癌患者外周血CK+腫瘤細胞和VCA－IgA抗體滴度對治療后復發的影響

復發與否患者治療前檢測的外周血CK+CTCs中位數分別為5(四分位數間距范圍5－6)和3(四分位數間距范圍1－4)，P＜0.01，差異顯著。但復發與否患者治療前檢測的中位VCA－IgA滴度無顯著差異，見表2。

表2 復發與否患者治療前CK8/18+循環腫瘤細胞及VCA－IgA抗體滴度對比Table 2.CK8/18+circulating tumor cells(CTCs)and VCAIgA antibody titers before treatment in the patients with(n=17)or without(n=59)relapse

4 治療前檢測的鼻咽癌患者外周血CK+腫瘤細胞對鼻咽癌患者復發率的影響

63例治療前外周血檢測到CK+腫瘤細胞的患者有17例治療后復發(27.0%)，而13例治療前沒檢測到 CK+腫瘤細胞的患者無1例復發(P＞0.05)。

治療前VCA－IgA滴度≥1∶80患者的復發率為25.0%(3/12)，而VCA－IgA滴度＜1∶80的復發率為21.9%(14/64)，P＞0.05。

5 生存率分析

治療前沒有檢測到外周血CK+腫瘤細胞患者的2年無復發生存率100%，治療前檢測到外周血CK+腫瘤細胞個數分別為1、2、3、4、5、6 的患者 2 年無復發生存率分別為 100%、100%、94.1%、71.4%、53.3%、44.4%，差異顯著(P＜0.01)，外周血CK+腫瘤細胞個數在3以上，無復發生存率逐漸下降;治療前沒有檢測到外周血CK+腫瘤細胞及檢測到CK+腫瘤細胞個數分別為1、2、3、4、5、6 的患者 2 年總生存率分別是 100%、100%、100%、100%、100%、80.0%、77.8%(P＞0.05)，外周血CK+腫瘤細胞個數在5以上，總生存率逐漸下降，見圖2。

治療前VCA－IgA＜1∶80及≥1∶80患者的2年無復發生存率分別為77.8%和80.6%(P＞0.05)，2年總生存率分別為88.9%和94.0%(P＞0.05)，均無顯著差異，見圖3。

6 單因素分析及Cox多因素分析

單因素分析結果顯示治療前外周血CK+CTCs的檢測個數明顯影響了鼻咽癌患者的無復發生存率(P＜0.01)，把治療前CK+CTCs的檢測個數及患者的臨床參數納入Cox多因素分析模型中，結果顯示外周血CK+CTCs的檢測個數是影響患者無復發生存最重要的預后因子[P＜0.01;hazard ratio(HR)=3.320;95% confidence interval(CI)=2.073－5.318]，另外，療效及臨床分期也是影響患者無復發生存的重要的預后因子，見表3。

Figure 1.Circulating tumor cells detected in the peripheral blood of patients with nasopharyngeal cancer(×400).A:one CK8/18+cell was observed with long－pass UV filter;B:the cell nucleus(blue fluorescence)stained by DAPI was visible with narrow －pass UV filter.圖1 鼻咽癌患者外周血中檢測到的循環腫瘤細胞

Figure 2.Relapse－free survival(A)and overall survival(B)with different numbers of CK+CTCs.圖2 CK+CTCs的無復發生存曲線及總生存曲線

Figure 3.Relapse－free survival(A)and overall survival(B)with different levels of serum VCA － IgA titers.圖3 不同血清VCA－IgA滴度的無復發生存曲線及總生存曲線

表3 無復發生存的Cox多因素分析Table 3.Summary of relapse－free survival analyses by multivariate Cox proportional hazards model(n=76)

總生存的單因素分析結果顯示治療前外周血CK+CTCs的檢測個數、年齡、療效、臨床分期明顯影響了鼻咽癌患者的總生存(分別為 P＜0.01、P＜0.05、P ＜0.01、P ＜0.05);把治療前 CK+CTCs的檢測個數及患者的臨床參數納入Cox多因素分析模型中，結果顯示外周血CK+CTCs的檢測個數及年齡是影響患者總生存的重要預后因子(P＜0.05;HR=3.639;95%CI=1.303－10.158;P=0.050;HR=5.190;95%CI=1.001－26.904)，見表4。

表4 總生存的Cox多因素分析Table 4.Summary of overall survival analyses by multivariate Cox proportional hazards model(n=76)

討 論

遠處轉移是NPC治療失敗的主要原因，頸淋巴結轉移是目前判斷NPC預后的重要因素。然而，頸淋巴結轉移狀態對預后的預測準確率并不理想，部分早期患者亦可出現遠處轉移，因此亟需尋找更有效的預測指標。大量基礎和臨床研究顯示，外周血中檢測到的腫瘤細胞是一個潛在的預后因素[1－5]。

檢測實體腫瘤微轉移的方法主要有免疫細胞化學(immunocytochemistry，ICC)、分子生物學技術(PCR等)及流式細胞學技術。目前為止，ICC仍是檢測上皮性惡性腫瘤患者骨髓與外周血中微轉移細胞的最普遍、最成熟、最標準的方法。而檢測癌癥患者骨髓或外周血中腫瘤細胞最廣泛使用的標志物就是CK，是表皮細胞或表皮細胞來源的癌細胞胞漿內的細胞骨骼蛋白的主要組成成分。已有大量臨床研究證實，CK是檢測乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌和喉鱗癌的一個特異性較高的標志物[9，10]。我們的前期研究結果顯示在ICC的基礎上，將傳統的免疫磁珠富集及免疫熒光細胞化學技術結合應用，使用特制的專有EpiSep玻片和熒光雙標循環腫瘤細胞技術，其敏感性較高，可在107的外周血單個核細胞中檢測到1個腫瘤細胞，且簡單、快捷，特異性高達100%，在正常人的外周血中未檢測到CK8/18+細胞，與上述方法比較，該方法具有較高的敏感性和特異性[6，7]。本研究也在正常人的外周血中未檢測到CK8/18+細胞，進一步驗證了該方法的特異性。

本研究使用改良IME－FICC法檢測治療前鼻咽癌患者外周血循環腫瘤細胞，比較了復發與否患者治療前檢測的鼻咽癌患者外周血CK+CTCs中位數，兩者差異顯著。但復發與否患者治療前檢測的中位VCA－IgA滴度無顯著差異。外周血CK+腫瘤細胞個數在3以上，無復發生存率逐漸下降。外周血CK+腫瘤細胞個數在5以上，總生存率有下降趨勢，但未達統計學差異。VCA－IgA滴度不能預測生存。Cox多因素分析結果也一樣。

其他一些學者亦報道了使用類似檢測方法檢測惡性腫瘤外周血循環腫瘤細胞的研究結果。Liu等[11]對轉移性乳腺癌(MBC)系統治療期間CTCs和FDG－PET/CT監測的預測價值進行了比較。開始新的一系列治療并且在基線以及治療期間9到12周(治療中)接受了CTCs計數和FDG－PET/CT掃描檢查的MBC患者進行了一項回顧性分析。按照治療中CTCs計數結果[好(＜5個CTCs/7.5 mL血液)或差(≥5個CTCs/7.5 mL血液)]，對患者進行了分類。對治療中的CTCs計數和FDG－PET/CT反應進行了比較。結果發現在102名可評價的患者中，中位總生存時間是14個月(范圍:1到＞41個月)。在102名可評價患者的68名(67%)中，治療中CTCs水平與FDG－PET/CT反應有關。在單變量分析中，治療中CTCs計數和FDG－PET/CT反應可預測總生存期(分別P＜0.01和P＜0.01)。在34名治療中CTCs少于5個的不一致患者中的31名(91%)，FDG－PET/CT可預測總生存期(P＜0.01)。在多變量分析中，僅治療中CTC水平保持顯著(P＜0.01)。該研究結果顯示除了代謝反應之外，治療監測期間檢測到5個或更多的CTCs可準確預測MBC的預后。Okegawa等[12]使用CellSearch系統(另一種免疫磁珠富集結合熒光雙標方法)，對循環腫瘤細胞是否能夠預測激素難治性前列腺癌患者的生存期進行了評價。此系統利用基于上皮細胞黏附前列腺癌抗體的免疫磁性捕捉和自動染色方法開發。對從64名激素難治性前列腺癌患者采集的血樣進行了分析。結果顯示在64名患者中，32名患者(50%)有至少5個循環腫瘤細胞，他們的中位總生存期是13.0個月，而循環腫瘤細胞數量少于5個的患者中位總生存期為20.0個月(P＜0.01)。根據單變量分析和多變量分析，循環腫瘤細胞和前列腺特異性抗原倍增時間是預測總生存期有意義的參數。與在開始循環腫瘤細胞檢測之后，從腫瘤細胞水平未升高轉變為升高的患者相比，從升高轉變為未升高的患者，總生存期較長(P＜0.05)。該研究結果表明循環腫瘤細胞可能是激素難治性前列腺癌患者總生存期的獨立預測因素。

由于早中期鼻咽癌患者的生存期較長，到本研究截止時間(2010年12月31日)，76例患者中位隨訪時間25個月，最短5個月，最長35個月，目前大部分患者仍在隨訪當中，經過初步統計分析結果顯示外周血中的CK8/18+循環腫瘤細胞是初治鼻咽癌患者較重要的預后因子，仍需進一步擴大病例數及延長隨訪時間，進一步驗證外周血中CK+循環腫瘤細胞在初治鼻咽癌患者的臨床意義。該方法經驗證后可成為國際上預測鼻咽癌復發及血道轉移早期診斷的標準，并有利于指導該類患者采用何種治療方案并觀測療效。

總的來說，我們使用前期發展的這個新的檢測循環腫瘤細胞的方法，初步驗證了鼻咽癌患者循環腫瘤細胞陽性率與患者無復發生存及總生存有關，而VCA－IgA滴度不能預測生存。到目前為止，國內外還未見到類似的報道。

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