NCA增加心肌收縮力的作用研究*

鐘 鑫， 賈洪麗， 侯俊青， 王育文， 時 颯， 李志韜

(哈爾濱醫科大學1病理生理教研室，黑龍江生物醫藥工程重點實驗室，2附屬第二醫院檢驗科，黑龍江哈爾濱150081)

NO影響心臟功能的作用已經被廣泛報導，而作為它的去電子形式 －硝酰基(nitroxyl，HNO)對心臟功能的影響最近才被關注[1]。HNO在正常及衰竭[2，3]心臟都起到正性、非負荷依賴性肌力作用。研究表明HNO具備β受體激動劑的作用且不被β受體阻滯劑所阻斷。NO或硝酸鹽所產生的HNO在體內對心血管活動作用非常明顯，因為后者在靜息心肌上只表現適度的正性肌力效應[4]。與NO不同的是，如果細胞內還原當量的含量增加，HNO活性則明顯減低甚至消失[10]，該結果支持了HNO基本化學作用中以硫基為靶點的論斷[1]。

HNO生理作用表明其可以作為心衰的一種新型治療手段，同時增加了對心衰細胞和分子機制進一步的理解。HNO能夠刺激鈣離子從心肌及骨骼肌[5]的ryanodine受體 (RyR)釋放。在心肌細胞，最初研究資料表明此作用是不依賴cGMP及cAMP的信號轉導方式[6]。除對鈣離子影響之外，HNO也可能與原肌球蛋白(tropomyosin，Tm)相互作用改變其收縮反應。NO及其相關物質如過亞硝酸鹽[7，8]則以cGMP依賴的方式減低肌原纖維對鈣離子的反應能力。HNO在可調節性細肌絲和/或肌原纖維蛋白上可能作用于巰基靶點改變張力的產生。

以往研究使用HNO供體，Angeli’s salt(AS)。AS不是純HNO供體，而是同時釋放HNO和亞硝酸鹽[9]。亞硝酸鹽不刺激心肌產生收縮性反應，在體內主要導致血管舒張[3]。乙酸1－亞硝基環已酯(1－nitrosocyclohexyl acetate，NCA)不釋放亞硝酸鹽，是較純的HNO供體，其發展將對HNO生化作用及機制進行更有效的分析。目前的研究用來檢測NCA是否改變了肌原纖維對鈣離子的反應能力。應用完整的大鼠梳狀肌，觀察了HNO供體NCA對心臟興奮 －收縮偶聯的影響。我們發現NCA以劑量依賴的方式增加[Ca2+]i水平及心肌收縮力，同時增強肌原纖維對鈣離子的反應性。NCA效應被還原劑二硫蘇糖醇 (dithiothreitol，DTT)阻斷，支持硫醇鹽在此過程中發揮靶點角色的論斷。

材料和方法

1 動物及試劑

20只Sprague－Dawley大鼠，體重250－300g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供;NCA由美國約翰霍普金斯大學高衛東實驗室贈予。

2 梳狀肌制備

大鼠腹腔注射戊巴比妥 (100 mg/kg)麻醉，沿胸骨中部切開暴露心臟，迅速摘除心臟并將其放置在標本盤中。室溫下(21－22℃)進行主動脈插管并用含有95%O2及5%CO2的解剖Krebs－Henseleit(K－H)液逆行灌流。K－H液組成(mmol/L):NaCl 120，NaHCO320，KCl 5，MgCl21.2，葡萄糖10，CaCl20.5 及2，3 － 丁二酮 20，pH 7.35 － 7.45。取自于右心室的梳狀肌置于張力換能器和刺激電極之間。然后，對其進行K－H液表面灌流(10 mL/min)，同時給予頻率為0.5 Hz的刺激。解剖顯微鏡下 (×40，分辨率10 μm)標準刻度線測量梳狀肌的尺寸。

3 張力及肌小節長度的測定

應用張力換能系統 (KG7，Scientific Instruments GmbH)對收縮力進行測量并以mN/mm2橫斷面積來表示。肌小節長度通過激光衍射法[10]進行測量。通過網狀二極管線陣系統 (RC0100－RG512，EG＆G Reticon)檢測肌肉中部衍射光線。衍射的初級光強度被整合，應用定制的肌小節長度檢測系統(University of Calgary)測出光強度分布中值，從而決定肌小節長度。實驗過程中靜息肌小節長度設定為2.2 －2.3 μm。

4 [Ca2+]i測定

應用Fura－2游離酸的形式對[Ca2+]i進行測定[11]。Fura－2鉀鹽采用離子透入法用玻璃電極顯微注射入一個細胞，經縫隙連接擴散至整個肌組織。微電極頂端 (直徑0.2 μm)充滿Fura－2鹽溶液 (1 mmol/L)，其余部分用150 mmol/L KCl充滿。在靜息肌組織中成功用微電極刺入表面細胞后，不間斷傳送5－10 nA超極化電流15 min。在一些肌組織不同部位可以重復注射 (最多3－4次)，每個部位注射持續時間 ＜10 min以達到較好的信噪比。如前所述:此負載不影響張力發展[11]。Fura－2回波熒光在380 nm及340 nm激發并測定，在510 nm用光電倍增管 (R1527，Hamamatsu)收集熒光并進行數字化分析。通過下列方程得出[Ca2+]i(減去自發熒光):[Ca2+]i=K’d(R － Rmin)/(Rmax－R)。R是實測的熒光率 (340/380)，K’d是表觀解離常數，Rmax是[Ca2+]i飽和時340 nm/380 nm 比率，Rmin是[Ca2+]i為 0時 340 nm/380 nm 比率。K’d，Rmax及 Rmin的值由前述體內校準法[11]所決定。

5 梳狀肌穩態激活作用及去肌膜心肌組織收縮力的測定

Ryanodine(1.0 μmol/L)應用于穩態激活作用。暴露于 ryanodine 15 min后，在多種[Ca2+]o(0.5－20.0 mmol/L)下以10 Hz頻率刺激肌組織，不同水平的強直被暫時(4－8 s)誘導出現。1%Txiton X－100應用于梳狀肌去肌膜反應。心肌組織被1%Txiton X －100作用10 min后，膜性結構破壞，僅保留蛋白質骨架結構進行實驗。實驗過程均在室溫下(20－22℃)進行。

6 Western blotting檢測

取右心室心肌組織蛋白提取液，室溫下SDSPAGE電泳，4℃轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，常規洗脫，相應Ⅰ抗 (1∶3 000稀釋)和Ⅱ抗 (1∶2 000稀釋)孵育，反復洗膜后堿性磷酸酶試劑顯色。Quality圖像分析系統對免疫印記結果進行定量分析。

7 統計學處理

結 果

1 NCA增加完整大鼠梳狀肌收縮力的作用強于增加[Ca2+]i效應

圖1可見，給予NCA出現典型的收縮力及相應的[Ca2+]i變化。收縮力的增強不是由于K －H緩沖液的堿化所致，因為檢測緩沖液pH不發生變化。圖1顯示收縮力增強而舒張力變化不明顯，同時，收縮期[Ca2+]i增加而舒張期[Ca2+]i不變。兩者均增加的情況下，收縮期力的增加比收縮期[Ca2+]i變化更為顯著，該結果支持NCA增加肌原纖維對鈣離子的敏感性。

Figure 1.Changes of force(B，D)and[Ca2+]itransient(A，C)treated with various concentrations of NCA.A，B:time－course changes;C，D:changes in systolic and diastolic phases.Temperature:22 ℃;sarcomere length=2.2 μm;[Ca2+]o=0.5 mmol/L±s.n=8－9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs before drug.圖1 收縮力與[Ca2+]i的變化

不同頻率條件下 (0.5－3.0 Hz)同對照組相比，NCA處理組始終表現明顯更高的收縮力(P＜0.01)，而[Ca2+]i變化則無明顯差別 (P ＞0.05)，見圖2。

Figure 2.Changes of force(A)and[Ca2+]itransient(B)at different frequencies(0.5－3.0 Hz)before and after NCA treatment.Experimental temperature was 22℃.Sarcomere length was set at 2.2 μm and[Ca2+]o=0.5 mmol/L.±s.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 收縮力－頻率相互關系

2 NCA增加完整大鼠梳狀肌對鈣離子的反應性

對照組最大鈣離子活化張力為(90.0±4.2)mN/mm2，達到 50% 活性需要[Ca2+]i(Ca50)為(0.57±0.03)μmol/L。給予NCA后，心肌收縮力峰值增加[(124.0±15.0)mN/mm2，P ＜ 0.05 vs control]，達到 50% 活性需要[Ca2+]i明顯降低[(0.39±0.01)μmol/L;P ＜ 0.01 vs control]。給予NCA的心肌組織，其希爾系數沒有受到影響 (3.94±0.18 vs 4.92 ±0.84，P＞0.05)。由此可見，NCA/HNO可以增強最大鈣離子活化張力。給予NCA后，不同細胞外鈣濃度 (0.01 －100 μmol/L)去肌膜心肌組織心肌收縮力峰值增加，Ca50降低[NCA － group，Ca50=0.3 μmol/L，P ＜ 0.01 vs control(1.35 μmol/L);Fmax=(90.1 ± 1.6)mN/mm2，P ＜0.05 vs control[(85.2 ± 1.2)mN/mm2]，見圖3。

3 NCA誘導下張力發展對細胞內還原當量的敏感性

Figure 3.Steady－state force－Ca2+relations in intact(A)and skinned(B)muscles.±s.n=9(A)or n=6(B).*P ＜0.05 vs control.圖3 NCA增加心肌纖維對Ca2+反應性

DTT對于基本的收縮力無效;然而，它能阻斷NCA(20 μmol/L)誘導的Ca2+敏感作用。DTT在5－10 min內逆轉NCA增加收縮力作用，見圖4。在無DTT存在條件下，收縮力將保持其興奮性長達20 min以上。由此可見，DTT可以阻止并逆轉NCA對收縮力的作用效果。

Figure 4.DTT(5 mmol/L)not only prevented but also reversed the effect of NCA on force development.±s.n=6.*P＜ 0.05 vs NCA.圖4 DTT影響NCA增加收縮力的作用

4 NCA增加心肌收縮力通過肌原纖維蛋白質巰基翻譯后修飾來實現

非還原條件下 (無DTT)NCA/HNO使肌原纖維(如Tm)分子發生交聯，而還原條件則交聯條帶消失，見圖5。

Figure 5.Western blotting of cardiac non－ reducing(A)and reducing(B)tropomyosin(39 kD).A cross－ linking band(78 kD)in tropomyosin was seen under non－ reducing condition.There was no change in reducing tropomysim.M:marker.10 μg，20 μg and 30 μg:the total protein loading quantity.圖5 NCA在還原條件下對Tm的翻譯后修飾作用

討 論

本實驗首次研究了NCA提供的HNO在分離、完整的心肌組織上產生一種直接劑量依賴性的正性變力作用。該作用不僅包括增加了心肌收縮力和[Ca2+]i瞬時電流峰值，而且由于最大[Ca2+]i升高活化了張力，使得這些變化在敏感性上的增長是不對稱的。此反應與NO作用效果不同，可被還原劑DTT所阻斷，同時具備較強的氧化還原反應敏感性。

NO與HNO僅相差1個電子。然而，HNO被認為能應用巰基化合物和高鐵蛋白進行加成反應[12]而NO則不能。NO的靶點首先是非氧合細胞溶質內可溶解性二價鐵鳥苷酸環化酶，而HNO生物活性的主要靶點則是巰基蛋白質或巰基肽[1]。盡管NO cGMP非依賴性收縮效應已經被證實，但大部分NO對心臟的作用仍與cGMP/PKG激活作用相關。一項重要的證據支持cGMP/PKG的激活是NO(及其被氧化的同源物質)對心臟進行調節的主要轉導途徑，借此減低了肌原纖維對Ca2+脫敏后的收縮性[7]。這樣的脫敏作用被認為對加速心肌舒張具有重要意義。該作用可因PKG藥物阻斷或遺傳缺失，或心肌鈣蛋白I在Ser23/24位點磷酸化[13]而被抑制。活性氮類物質過亞硝酸鹽也能降低肌原纖維對鈣離子的反應性，導致心臟抑制效應，部分效應是由 PKG介導的[8]。

由NCA提供的HNO反應則完全不同，這可能由于其與鳥苷酸環化酶或作為收縮機制的主要靶點半胱氨酸殘基相互作用。研究表明HNO對選取的硫醇鹽(－S·)發生反應，對巰基化合物亞群(－SH)也有高反應性[1]，這些反應都證實了HNO具有選擇性和作用可逆性。目前和以往資料表明，收縮作用可迅速用DTT逆轉。在分離的家兔心臟肌漿網囊泡[5]或大鼠心肌細胞上[8]研究發現HNO誘導的肌漿網鈣離子的釋放也可被DTT完全逆轉。最近在酵母的一項研究中也顯示了HNO選擇性，不改變細胞內巰基化合物前提下，HNO在其活化位點硫醇鹽殘基內具有特異性的靶點磷酸甘油醛脫氫酶[14]。我們假設NCA/HNO可以在肌原纖維和/或調節蛋白質內的半胱氨酸“靶點”上誘發相似的具有選擇性的化學修飾，Western blotting證實NCA在非還原條件下使肌原纖維的Tm分子發生交聯，該作用可能促進橫橋轉換率發生變化，進而增加收縮張力的產生。進一步的研究旨在明確這些變化的分子性質和位點。

HNO增加最大Ca2+活化張力機制至今尚不清楚。然而，研究表明僅最大Ca2+活化張力的增加即可導致橫橋的變化。張力發展依賴于相關橫橋的數目及其動力學特征。橫橋轉換率能明顯影響張力 －pCa之間的相互關系，從而增加與Ca2+活化張力相關性的比率。HNO誘導的橫橋循環性的改變是引起改變收縮性的唯一途徑，這與在調節蛋白質內進行變化來調節收縮性的機制密切相關。

我們的研究也證實了在完整心肌組織內[Ca2+]i增加是由NCA誘導的。盡管[Ca2+]i的增加與肌原纖維致敏作用的相關性已經被證實，但這種增加可能是在較高NCA劑量條件下成為增強心肌收縮力的基礎。在分離的小鼠肌細胞實驗研究中，HNO可以增加鈣離子的吸收及其從肌漿網的釋放，適當增加瞬時電流而不出現舒張期鈣離子的逆轉[6]。這可以對目前研究中所觀察的[Ca2+]i的變化進行解釋。這些機制與致敏效應一起表明HNO對心臟肌原纖維及肌漿網具有新奇的效應，可以在缺乏能量供應的條件下增加心肌潛在的收縮能力。

總言之，NCA提供的HNO能增強大鼠心肌組織收縮力和細胞內鈣瞬變，且前者變化幅度大于后者，這種作用部分由于肌原纖維對鈣離子敏感性的增加所致。該作用對于還原性環境較敏感。該作用的主要分子靶點可能是Tm半胱氨酸的巰基蛋白質。進一步研究需要證實NCA對心力衰竭動物模型心肌收縮力的作用效果，為實現NCA/HNO的臨床應用奠定基礎。

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