HPLC－ELSD法測定宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷的含量

張 偉 馬久太，2 王曉梅，2 單 娜，2 劉 峰，2 南景一，2

(1陜西步長制藥有限公司，陜西咸陽，712000;2陜西省中藥制藥工程技術研究中心)

宮瘀凈膠囊是在古方“當歸補血湯”“人參黃芪湯”和“理氣散瘀湯”基礎上，結合現代醫學研究，精制而成的一種純中藥新產品，由黃芪、當歸、三七等8味中藥組成，具有益氣養血、祛瘀止血功能，對于藥物流產后導致的氣血兩虛、瘀血阻滯型陰道出血等病癥的治療，具有很好的療效。原質量標準采用薄層色譜掃描法測定黃芪甲苷，存在靈敏度低、重現性差、操作繁瑣等缺點。為了保證產品質量，提高分析方法的靈敏性、重現性及方便性，我們采用HPLC－ELSD對宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷進行含量測定，并對方法學進行了研究，報道如下。

1 儀器與試藥

3400A型高效液相色譜儀;蒸發光散射檢測器;AR1140電子天平;KQ·250TB超聲波清洗器;ΜPT－1－10高純水機。黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號110781－200613)，宮瘀凈膠囊(陜西步長制藥有限公司生產，批號090411、090621、090814)，乙腈為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈－水(33∶67)為流動相;蒸發光散射檢測器漂移管溫度為50℃，氣流量為1.5L/min，增益為4。理論板數以黃芪甲苷峰計算應不低于4000。

2.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，以甲醇溶解，制成每1mL含1.154mg的溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品10粒，精密稱定，傾出內容物，研細，約取4g，精密稱定，加硅藻土1g，拌勻，置索氏提取器中，加石油醚(60℃ ～90℃)回流提取至無色，石油醚棄去，取出濾紙筒，烘干，再置索氏提取器中，以甲醇回流提取5.5h，回收甲醇，蒸干，殘渣加20mL熱水分次轉移至分液漏斗中，加正丁醇飽和的水20mL稀釋，用水飽和的正丁醇提取5次，每次20mL，合并正丁醇液，用0.5%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次20mL，棄去堿液，繼用正丁醇飽和的水洗至中性，棄去水液，正丁醇液水浴蒸干，用甲醇溶解并轉移至5mL量瓶內，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。

2.4 干擾性試驗 依據處方制備不含黃芪的樣品，按照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液與陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，陰性對照溶液色譜圖中，在黃芪甲苷對照品峰與供試品溶液色譜圖相應保留時間處未出色譜峰，基線分離良好。

2.5 標準曲線及線性范圍 分別配制濃度為0.115mg/mL、0.288mg/mL、0.577mg/mL、0.866mg/mL、1.154mg/mL的系列標準溶液，精密吸取各10μL進樣，按“2.1”色譜條件進行測定，以進樣量對數值(X)為橫坐標，峰面積對數值(Y)為縱坐標繪制標準曲線(見圖1)，得回歸方程式:Y=1.732X+2.013，r=0.9999(n=5)。結果表明，黃芪甲苷在 1.154～11.540μg范圍與色譜峰面積呈良好的線性關系。見圖1。

圖1 黃芪甲苷標準曲線

2.6 精密度試驗 取宮瘀凈膠囊(批號090411)內容物適量，按上述供試品溶液制備方法處理并按色譜條件進行測定，連續進樣6次，記錄黃芪甲苷的峰面積，見表1，RSD=1.05%，說明該方法精密度良好。

2.7 重復性試驗 取宮瘀凈膠囊(批號090411)內容物適量，按上述供試品溶液制備方法制備6份供試液，在上述色譜條件下進樣測定，記錄黃芪甲苷的峰面積，見表2，RSD為1.09%，說明該方法重復性好。

表1 精密度試驗結果

表2 重復性試驗結果

2.8 加樣回收率試驗 取已測定含量的宮瘀凈膠囊樣品內容物(批號090411)適量，共5份，精密稱定，分別加入對照品溶液1mL(1.154mg/mL)，按供試品溶液制備方法處理，測定峰面積，計算加樣回收率，結果見表3。平均回收率為99.85%，RSD為1.90%。

表3 黃芪甲苷回收率測定結果

2.9 穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號090411)，分別于 0、1、2、4、8、12h 進行測定，記錄峰面積。其RSD為0.96%(n=6)，結果表明結供試品溶液在12h內穩定。

表4 穩定性試驗結果

2.10 樣品含量測定 取宮瘀凈膠囊樣品(批號090411、090621、090814)適量，精密稱定，按供試品溶液制備方法處理并按色譜條件進行測定，記錄黃芪甲苷的峰面積并計算其含量，結果見表5。采用薄層色譜法作為對照實驗，測定宮瘀凈膠囊中的黃芪甲苷含量。先用二次展開法將宮瘀凈膠囊中的黃芪甲苷與三七中的皂苷分離，然后采用薄層掃描色譜法測定膠囊中的黃芪甲苷含量，結果見表5。對3批宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷分別進行t檢驗，該方法與本實驗中黃芪甲苷含量測定結果進行比較，無顯著性差異。

表5 宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷含量測定結果

3 討論

黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分，常作為指標性成分應用于黃芪藥材及其制劑的質量控制。黃芪甲苷含量多采用薄層掃描法測定［1－2］，而薄層掃描法的穩定性和重現性相對較差，且操作繁瑣。黃芪甲苷成分的紫外末端吸收較差(λmax=210nm)［3］，采用HPLC－UV吸收強度較弱，受溶劑影響很大，穩定性以及準確性均受到影響，使分析很難進行。蒸發光散射檢測器為質量型檢測器，不受樣品的光學特性、官能團的影響［4－5］，分離效果很好，靈敏度及穩定性高。本品為中藥復方制劑，所含成分復雜、干擾大，試驗采用高效液相－蒸發光散射檢測器法檢測宮瘀凈膠囊中黃芪甲苷的含量，結果專屬性好、方法穩定、可靠，可作為該制劑的質量控制的方法。

［1］王寶，蘇健，魯靜.黃芪甲苷的檢測在中藥質控中的應用.中國中藥雜志，1996，21(3):161.

［2］劉艷，付超美，王世宇.薄層掃描法測定強骨顆粒中黃芪甲苷的含量.成都大學學報(自然科學版)，2008，18(2):125.

［3］劉曄，吳禾.RP－HPLC法測定黃芪中黃芪甲苷的含量.中草藥，1998，29(S1):83.

［4］陳玉杰，金紅星，李萍，等.基于HPLC－ELSD法的中藥復方制劑中黃芪甲苷含量測定.安徽農業科學，2009，29(35):41－43.

［5］孔曉華，雷玉萍.復肝能片質量控制方法的研究.中國現代藥物應用，2010，4(10):109 －110.