吉西他濱對人肝癌細胞凋亡和分化的影響

劉寶華 谷 玥 姜曉明 李海峰 (吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

近年發現吉西他濱(Gemcitabine)是一種高效低毒的抗代謝類抗腫瘤新藥，目前已廣泛應用于肺癌和胰腺癌〔1，2〕，但對肝癌細胞的作用效果尚不明確。本研究以人肝癌細胞株(SMMC7721)細胞為靶細胞，觀察吉西他濱在體外對人肝癌細胞凋亡和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與試劑 SMMC7721細胞(吉林大學基礎醫學院提供)，DMEM/F12培養基(GIBCO公司)，小牛血清(Hyclone公司)，二甲基亞砜(DMSO)，四唑氮藍鹽(MTT)(Sigma公司)。γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)和堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(上海長征醫學科學有限公司)。甲胎蛋白(AFP)、血清清蛋白(ALB)放免測定盒(中國原子能科學研究院)。

1.1.2 儀器 Sanyo超凈工作臺，Olympus倒置顯微鏡，EM2000透射電鏡，流式細胞儀Epics XLⅡ型。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人SMMC7721細胞常規培養于含10%小牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的DMEM/F12培養液中，在37℃、5%CO2培養箱內培養。

1.2.2 細胞凋亡率測定 取對數生長期細胞，制成1×105/L的細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔加細胞懸液100 μl，培養過夜。不同濃度吉西他濱對肝癌細胞凋亡的影響:空白對照組、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 吉西他濱處理組分別作用48 h后，制備各細胞懸液，加入固定破膜劑和碘化丙啶(PI)染液，室溫避光反應30 min后上機檢測，每個標本檢測104個細胞，重復計數3次，流式細胞計數測定凋亡率。吉西他濱不同作用時間對肝癌細胞凋亡的影響:10 mg/L吉西他濱作用于肝癌細胞 24、48、72、96、120 h，進行 PI染色，流式細胞計數測定凋亡率。

1.2.3 γ-GT和ALP活性測定 細胞用0.25%胰酶消化，2 000 r/min離心10 min后，加入預冷的0.25%脫氧膽酸鈉溶解細胞，然后4℃ 12 000 r/min離心20 min，收集上清液，－70℃保存備用。按酶促反應試劑盒說明測定γ-GT和 ALP活性，總蛋白質含量用考馬斯亮藍法測定。γ-GT或ALP比活力(IU/g)計算公式γ-GT或ALP值 /總蛋白量。

1.2.4 AFP和ALB分泌量測定 收集經10 mg/L吉西他濱作用48 h及相應對照組的細胞培養液，4 000 r/min離心5 min，取上清冷凍干燥。細胞消化后染色計數活細胞數。將干燥后的培養液溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按放免試劑盒說明進行檢測，測定AFP和ALB的含量。

1.3 統計學分析 采用t、χ2檢驗。

2 結果

2.1 吉西他濱對SMMC7721肝癌細胞凋亡的影響

2.1.1 不同濃度吉西他濱對肝癌細胞凋亡的影響 1.25、2.5、5、10、20、40 mg/L 吉西他濱作用肝癌細胞 48 h 后，凋亡百分率分別為 3.25% ±0.62%、4.68% ±0.73%、9.63% ±1.56%、18.84% ±4.26%、23.56% ±4.64%、25.85±4.67%，對照組為2.28% ±0.55%，提示對肝癌細胞的凋亡率隨著吉西他濱濃度的增大而升高，其中10 mg/L以上組與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。

2.1.2 吉西他濱(10 mg/L)不同作用時間對肝癌細胞凋亡的影響 隨作用時間的延長，凋亡率逐漸升高，24、48、72、96、120 h，凋亡率分別為 4.37% ±0.76%、18.34% ±1.47%、26.49% ±2.43%、30.26% ±2.45%、33.58% ±2.65%，在72 h肝癌細胞凋亡率與24 h相比明顯增大(P＜0.01)。而120 h與72 h相比無統計學差異(P＞0.05)。提示吉西他濱促進肝癌細胞凋亡的效果在72 h時最為明顯。

2.2 吉西他濱對肝癌細胞γ-GT活性、ALP活性及AFP、ALB分泌的影響 吉西他濱組培養48 h后γ-GT比活力及ALP比活力明顯低于對照組(P＜0.05)，AFP分泌量較對照組細胞顯著降低，ALB分泌顯著升高，與對照組比較均有顯著差異(P＜0.01)。見表1。

表1 吉西他濱對肝癌細胞γ-GT活性、ALP活性、AFP、ALP分泌的影響(±s)

表1 吉西他濱對肝癌細胞γ-GT活性、ALP活性、AFP、ALP分泌的影響(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別γ-GT(IU/g)ALP(IU/g)ALB(g/L)AFP(μg/L)對照組 14.59±0.89 352.28±27.37 50.49±4.09 78.54±6.88吉西他濱組 10.52±0.6131)317.58±21.1931)85.59±7.6932)42.65±4.2732)

3 討論

吉西他濱是細胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細胞，即S期細胞，在一定條件下可以阻止G1期向 S 期的進展〔3，4〕。

本研究中細胞凋亡實驗結果顯示，10～40 mg/L吉西他濱能顯著促進肝癌細胞的凋亡，10 mg/L作用凋亡百分率可達18.84%±4.26%，并且吉西他濱對肝癌細胞的凋亡作用具有隨時間和劑量升高而增強的效果。可見吉西他濱可以直接作用于肝癌細胞，抑制細胞的生長，促進肝癌細胞凋亡。

為了探討肝癌細胞分化的定量指標，本實驗根據肝細胞的代謝特點，選擇了幾種反映肝細胞分化的特異性酶和蛋白為標志。γ-GT在正常鼠肝中的活性極低，而在肝癌時，由于癌細胞逆分化，類似胚胎期，此酶的生成增加，故血清γ-GT也呈中度或高度升高，臨床上也常把此酶作為觀察慢性肝炎伴肝硬化病人是否進展為肝癌的參考指標。ALP廣泛分布于人體的骨、肝、腸、胎盤等組織中，正常人血清中ALP主要來自骨和肝，約各占總活性一半。肝內占位性病變，如原發性肝癌、繼發性肝癌時，由于癌細胞可合成ALP，以致血中ALP中度甚至明顯升高。ALB是肝細胞分化成熟的指標。AFP則是公認的肝細胞增殖和惡變的重要標志物。本研究發現吉西他濱可抑制肝癌細胞合成、分泌γ-GT、ALP及AFP，并可相應增加 ALB分泌量。提示吉西他濱具有誘導肝癌細胞向良性細胞分化的作用，對其在臨床上的應用有指導價值。

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2 Schiller J H，Harrington D，Belani CP，et al.Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med，2002;346(2):92-8.

3 Hamada S，Satoh K.MSX2 overexpression inhibits gemcitabine-induced caspase-3 activity in pancreatic cancer cells〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(43):6867-70.

4 Rosell R，Felip E，Taron M，et al.Gene expression as a predictive marker of outcome in stage ⅡB-ⅢA-ⅢB non-small cell lung cancer after induction gemcitabine-based chemotherapy followed by resectional surgery〔J〕.Clin Cancer Res，2004;10(12):4215-9.