白介素-18促動脈粥樣硬化斑塊內細胞凋亡的作用

李巧汶 李志樑 邱 健 傅 強 (南方醫科大學珠江醫院心內科，廣東 廣州 50282)

目前認為，易損斑塊(VP)潰瘍、破裂、血栓形成是急性冠脈綜合征(ACS)發生的主要病理生理過程。炎癥是VP形成的最重要的機制之一，白介素-18(IL-18)作為在炎癥反應系統中發揮中心性作用的炎癥因子，不但與動脈粥樣硬化(AS)斑塊的發生、發展〔1，2〕，且參可能與 VP 的形成〔1，3〕，但 IL-18 促 VP 形成的機制尚不清楚。研究表明〔4，5〕，IL-18可誘導多種細胞發生凋亡，而斑塊內細胞凋亡是VP的重要特征之一。由此推測IL-18可能通過誘導斑塊內細胞凋亡促進VP的形成，但相關的證據缺乏。本研究通過IL-18刺激離體AS斑塊，觀察斑塊內的細胞凋亡指數及形態特征，旨在探索IL-18促進VP形成的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動脈粥樣硬化模型的制備 30只老年健康雄性新西蘭白兔，均為3月齡，平均體重2.2 kg，由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號0055273。新西蘭白兔予適應性喂養1 w后給予高脂飼料(內含1.5%的膽固醇、5%豬油和0.5%的膽鹽)10 w，食物和水根據動物的需求供給。10 w后，注射過量的戊巴比妥處死動物。解剖動物，暴露動物的腹主動脈，清除附著于動脈上的脂肪與組織，根據斑塊的分布把腹主動脈切割成60個血管塊，上述操作嚴格遵守無菌操作的原則。

1.2 離體標本分組及處理 采用析因設計，給予2種處理因素(4種刺激時間和3種刺激濃度)，以刺激時間和刺激濃度的不同組合作為新處理組，將60個動脈粥樣硬化斑塊標本隨機分入新處理組中(n=5)。把標本孵育在含血清的Ham's F10培養基，實驗組除培養基外分別加入250、50 μg/L兩種濃度的兔IL-18分別刺激0、1 d、4 d、7 d;對照組孵育在含血清的Ham's F10培養基0、1 d、4 d、7 d。所有標本待培養基顏色變為橙黃色時更換培養基，上述操作嚴格遵守無菌操作的原則。

1.3 標本大體染色及組織學特點的測量 經上述處理后，甲醛固定標本，常規石蠟包埋、切片，組織HE染色。使用Image-Pro Plus圖像分析軟件采集分析圖像，每個斑塊至少取10處測量纖維帽厚度取平均值，測量處包括最厚與最薄處，測量每個斑塊纖維帽厚度與脂核橫截面厚度的比值。

1.4 斑塊細胞凋亡檢測 采用原位凋亡試劑盒TUNEL法檢測。每張切片隨機觀察5個高倍視野(×400)，共計數300個細胞，計算TUNEL染色陽性的細胞所占百分比(凋亡指數)。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，用±s表示，析因方差分析多因素各組數據間均數的差異，線性相關分析法分析兩個變量間的相關性。

2 結果

2.1 不同IL-18刺激時間和濃度斑塊內細胞凋亡指數的變化AS斑塊內的細胞凋亡指數隨IL-18刺激的時間和濃度的改變而變化(P＜0.01)。隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊內的細胞凋亡指數有上升趨勢(P＜0.01)。見表 1，圖 1。

2.2 不同IL-18刺激時間和濃度斑塊帽/核比值的變化 AS斑塊的帽/核比值隨IL-18刺激的時間和濃度的改變而變化(P＜0.01)。隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊的帽/核比值有下降趨勢(P＜0.01)。見表2。

2.3 斑塊細胞的凋亡指數與帽/核比值的相關性分析 對斑塊細胞的凋亡指數與帽/核比值進行線性相關性分析，結果顯示，斑塊細胞的凋亡指數與帽/核比值呈顯著線性負相關(r=－0.776，P ＜0.001)。

表1 不同IL-18刺激時間和濃度斑塊內細胞凋亡指數的變化(±s，析因分析，n=5)

表1 不同IL-18刺激時間和濃度斑塊內細胞凋亡指數的變化(±s，析因分析，n=5)

?主效應的F統計量和P值，下表同

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表2 不同IL-18刺激時間和濃度時斑塊帽/核比值的變化(±s，析因分析，n=5)

表2 不同IL-18刺激時間和濃度時斑塊帽/核比值的變化(±s，析因分析，n=5)

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圖1 不同斑塊中的凋亡細胞(箭頭所示，×400)

3 討論

ACS是以冠狀AS斑塊侵蝕或破裂繼發的完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎的一組臨床綜合征，包括不穩定型心絞痛、ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死。一般認為，引起ACS發生的主要病理生理過程為VP的潰瘍、破裂、血栓的形成。炎癥反應與VP的形成密切相關，炎癥可通過斑塊內的炎癥細胞及其分泌的促炎癥因子使斑塊的纖維帽變薄、脂核變大，導致VP表型的形成。IL-18是一種新近發現的在炎癥反應中發揮重要作用的促炎癥介質，研究表明〔1～3〕，IL-18參與了AS斑塊的形成、進展乃至VP形成的整個過程。臨床資料也〔6〕顯示，ACS患者血漿IL-18的水平顯著升高，提示IL-18與VP的發生發展密切相關。然而，IL-18促VP發生發展的機制目前尚不清楚，本研究通過IL-18對離體AS斑塊的刺激，觀察IL-18對AS斑塊內細胞凋亡指數以及AS斑塊形態特征的影響，以探索IL-18促VP發生發展的可能機制。

本研究結果顯示，AS斑塊內的細胞凋亡指數隨IL-18刺激的時間和濃度的改變而變化，隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊內的細胞凋亡指數有上升趨勢。AS斑塊內細胞凋亡增加可增大斑塊內的壞死中心，促使纖維帽變薄，導致VP表型的形成，因此，斑塊內細胞凋亡是VP的主要特征之一。本研究結果提示，IL-18可能通過誘導斑塊內的細胞凋亡促進VP的形成。IL-18誘導斑塊內細胞凋亡的可能途徑包括:①IL-18能通過刺激機體釋放多種促炎癥介質(TNF、IL-1β、IL-6、iNOS)誘導細胞凋亡〔5〕。②IL-18 本身可直接激活外源性凋亡通路和內源性線粒體凋亡通路，誘導細胞凋亡。IL-18一方面可通過誘導TNF的產生、上調NK細胞和Th1細胞的Fas-L表達、增強的Fas-L型介導的細胞毒活性激活外源性凋亡通路〔7，8〕，另一方面，IL-18還可促進線粒體釋放細胞色素C從線粒體進入細胞質而激活內源性線粒體凋亡通路〔9〕。

從AS斑塊標本的形態特征進行分析，結果表明，AS斑塊的帽/核比值隨IL-18刺激的時間和濃度的改變而變化，隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊的帽/核比值有下降趨勢，引起斑塊趨于VP的形態特征。另外，斑塊內細胞的凋亡指數與帽/核比值的線性相關性分析顯示，斑塊內細胞的凋亡指數與帽/核比值呈顯著線性負相關，提示斑塊內的凋亡細胞增加促進VP形態特征的形成。斑塊內的細胞凋亡增加導致VP形成的可能機制包括:① 細胞凋亡后，一方面可釋放膽固醇，使AS斑塊核心形成、擴大，損傷纖維帽，另一方面，釋放蛋白酶和少量炎性因子，刺激巨噬細胞分泌基質降解蛋白酶，損傷纖維帽，致纖維帽變薄〔10〕，加速VP的形成;②凋亡細胞 (巨噬細胞)被吞噬清除過程中，可誘發炎癥反應，促進AS斑塊不穩定〔11〕。③巨噬細胞凋亡后，其數目減少，致使凋亡的平滑肌細胞、巨噬細胞等不能被有效吞噬，促進AS斑塊內脂質核心形成和擴大，使纖維帽易于破裂;④細胞凋亡后可釋放促血栓形成物質 (如組織因子等)〔12〕，促進血栓的形成。

可見，隨著隨著IL-18刺激時間的延長、刺激濃度的升高，斑塊內的細胞凋亡指數有上升趨勢，相反，斑塊的帽/核比值有下降趨勢，而斑塊內的細胞凋亡指數和斑塊的帽/核比值也呈顯著負相關，這就提示了IL-18通過誘導斑塊內的細胞凋亡可能是促進VP形成的重要機制。在臨床中，檢測血漿IL-18的濃度對VP診斷有一定的臨床意義，目前，已有不少學者〔13，14〕提出通過檢測AS斑塊內細胞凋亡以診斷VP;在VP的防治中，抑制IL-18的生物學效應及細胞凋亡將可能成為預防VP形成的重要手段。

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